میٹابولومکس مریض کے سیرم کے ہائی ریزولوشن ماس سپیکٹرو میٹرک تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے اعلی خصوصیت کے ساتھ سومی اور مہلک پلمونری نوڈولس کی تمیز کرتے ہیں۔

کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی (CT) کے ذریعہ شناخت شدہ پلمونری نوڈولس کی امتیازی تشخیص کلینیکل پریکٹس میں ایک چیلنج بنی ہوئی ہے۔یہاں، ہم 480 سیرم کے نمونوں کے عالمی میٹابولوم کی خصوصیت کرتے ہیں، بشمول صحت مند کنٹرول، سومی پھیپھڑوں کے نوڈولس، اور اسٹیج I پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما۔اڈینو کارسینوماس منفرد میٹابولومک پروفائلز کی نمائش کرتے ہیں، جبکہ سومی نوڈولس اور صحت مند افراد میٹابولومک پروفائلز میں زیادہ مماثلت رکھتے ہیں۔دریافت گروپ (n = 306) میں، سومی اور مہلک نوڈولس کے درمیان فرق کرنے کے لیے 27 میٹابولائٹس کے ایک سیٹ کی نشاندہی کی گئی۔اندرونی توثیق (n = 104) اور بیرونی توثیق (n = 111) گروپوں میں امتیازی ماڈل کا AUC بالترتیب 0.915 اور 0.945 تھا۔پاتھ وے کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما سیرم میں ٹرپٹوفن میں کمی کے ساتھ منسلک گلائکولٹک میٹابولائٹس سومی نوڈولس اور صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں، اور تجویز کیا گیا کہ ٹرپٹوفن اپٹیک پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں میں گلائکولائسز کو فروغ دیتا ہے۔ہمارا مطالعہ سی ٹی کے ذریعہ پائے جانے والے پلمونری نوڈولس کے خطرے کا اندازہ لگانے میں سیرم میٹابولائٹ بائیو مارکر کی قدر کو اجاگر کرتا ہے۔
کینسر کے مریضوں کے لیے بقا کی شرح کو بہتر بنانے کے لیے ابتدائی تشخیص بہت ضروری ہے۔امریکی قومی پھیپھڑوں کے کینسر اسکریننگ ٹرائل (NLST) اور یورپی نیلسن اسٹڈی کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ کم خوراک کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی (LDCT) کے ساتھ اسکریننگ زیادہ خطرہ والے گروپوں میں پھیپھڑوں کے کینسر سے ہونے والی اموات کو نمایاں طور پر کم کرسکتی ہے۔پھیپھڑوں کے کینسر کی اسکریننگ کے لیے LDCT کے بڑے پیمانے پر استعمال کے بعد سے، اسیمپٹومیٹک پلمونری نوڈولس کے حادثاتی ریڈیوگرافک نتائج کے واقعات میں مسلسل 4 اضافہ ہوتا جا رہا ہے۔پلمونری نوڈولس کو 3 سینٹی میٹر قطر 5 تک فوکل اوپیسٹیز کے طور پر بیان کیا گیا ہے۔ہمیں مہلکیت کے امکان کا اندازہ لگانے اور LDCT پر اتفاق سے پائے جانے والے پلمونری نوڈولس کی بڑی تعداد سے نمٹنے میں مشکلات کا سامنا ہے۔CT کی حدود متواتر فالو اپ امتحانات اور غلط مثبت نتائج کا باعث بن سکتی ہیں، جس سے غیر ضروری مداخلت اور ضرورت سے زیادہ علاج ہو سکتا ہے۔لہٰذا، ابتدائی مراحل میں پھیپھڑوں کے کینسر کی درست طریقے سے شناخت کرنے کے لیے قابل بھروسہ اور مفید بائیو مارکر تیار کرنے کی ضرورت ہے اور ابتدائی پتہ لگانے پر سب سے زیادہ سومی نوڈولس میں فرق کرنا ہے۔
جینومکس، پروٹومکس یا ڈی این اے میتھیلیشن8,9,10 سمیت خون کے جامع مالیکیولر تجزیہ (سیرم، پلازما، پیریفرل بلڈ مونو نیوکلیئر سیل) نے پھیپھڑوں کے کینسر کے لیے تشخیصی بائیو مارکر کی دریافت میں دلچسپی بڑھائی ہے۔دریں اثنا، میٹابولومکس نقطہ نظر سیلولر اختتامی مصنوعات کی پیمائش کرتا ہے جو اینڈوجینس اور خارجی اعمال سے متاثر ہوتے ہیں اور اس وجہ سے بیماری کے آغاز اور نتائج کی پیش گوئی کرنے کے لیے لاگو ہوتے ہیں۔مائع کرومیٹوگرافی-ٹینڈم ماس اسپیکٹرومیٹری (LC-MS) میٹابولومکس اسٹڈیز کے لیے وسیع پیمانے پر استعمال ہونے والا طریقہ ہے جس کی وجہ اس کی اعلیٰ حساسیت اور بڑی متحرک رینج ہے، جو مختلف فزیکو کیمیکل خصوصیات کے ساتھ میٹابولائٹس کا احاطہ کر سکتی ہے 11,12,13۔اگرچہ پلازما/سیرم کا عالمی میٹابولومک تجزیہ پھیپھڑوں کے کینسر کی تشخیص 14,15,16,17 اور علاج کی افادیت سے وابستہ بائیو مارکر کی شناخت کے لیے استعمال کیا گیا ہے، سومی اور مہلک پھیپھڑوں کے نوڈولس کے درمیان فرق کرنے کے لیے 18 سیرم میٹابولائٹ درجہ بندی کا ابھی زیادہ مطالعہ کرنا باقی ہے۔- بڑے پیمانے پر تحقیق.
Adenocarcinoma اور squamous cell carcinoma غیر چھوٹے سیل پھیپھڑوں کے کینسر (NSCLC) کی دو اہم ذیلی قسمیں ہیں۔مختلف سی ٹی اسکریننگ ٹیسٹ بتاتے ہیں کہ اڈینو کارسینوما پھیپھڑوں کے کینسر کی سب سے عام ہسٹولوجیکل قسم ہے 1,19,20,21۔اس مطالعہ میں، ہم نے کل 695 سیرم کے نمونوں پر میٹابولومکس تجزیہ کرنے کے لیے الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی-ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری (UPLC-HRMS) کا استعمال کیا، جس میں صحت مند کنٹرولز، سومی پلمونری نوڈولز، اور CT-ڈٹیکٹڈ ≤3cm شامل ہیں۔اسٹیج I پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کی اسکریننگ۔ہم نے سیرم میٹابولائٹس کے ایک پینل کی نشاندہی کی جو پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کو سومی نوڈولس اور صحت مند کنٹرول سے ممتاز کرتی ہے۔پاتھ وے کی افزودگی کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ غیر معمولی ٹرپٹوفن اور گلوکوز میٹابولزم پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما میں سومی نوڈولس اور صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں عام تبدیلیاں ہیں۔آخر میں، ہم نے LDCT کے ذریعے پائے جانے والے مہلک اور سومی پلمونری نوڈولس کے درمیان فرق کرنے کے لیے اعلیٰ خصوصیت اور حساسیت کے ساتھ ایک سیرم میٹابولک درجہ بندی قائم کی اور اس کی توثیق کی، جو ابتدائی تفریق کی تشخیص اور خطرے کی تشخیص میں مدد کر سکتا ہے۔
موجودہ مطالعہ میں، جنس اور عمر سے مماثل سیرم کے نمونے 174 صحت مند کنٹرولوں، سومی پلمونری نوڈولس والے 292 مریض، اور اسٹیج I پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما والے 229 مریضوں سے سابقہ ​​طور پر جمع کیے گئے۔695 مضامین کی آبادیاتی خصوصیات کو ضمنی جدول 1 میں دکھایا گیا ہے۔
جیسا کہ شکل 1a میں دکھایا گیا ہے، کل 480 سیرم کے نمونے، بشمول 174 صحت مند کنٹرول (HC)، 170 سومی نوڈولس (BN)، اور 136 اسٹیج I lung adenocarcinoma (LA) کے نمونے، سن یات سین یونیورسٹی کینسر سینٹر میں جمع کیے گئے تھے۔الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی-ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری (UPLC-HRMS) کا استعمال کرتے ہوئے غیر ہدف شدہ میٹابولومک پروفائلنگ کے لیے ڈسکوری کوہورٹ۔جیسا کہ ضمنی شکل 1 میں دکھایا گیا ہے، LA اور HC، LA اور BN کے درمیان تفریق میٹابولائٹس کو درجہ بندی کا ماڈل قائم کرنے اور تفریق پاتھ وے تجزیہ کو مزید دریافت کرنے کے لیے شناخت کیا گیا تھا۔سن یات سین یونیورسٹی کینسر سنٹر کی طرف سے جمع کیے گئے 104 نمونے اور دو دیگر ہسپتالوں کے ذریعے جمع کیے گئے 111 نمونے بالترتیب اندرونی اور بیرونی توثیق کے تابع تھے۔
دریافت کرنے والے گروہ میں ایک مطالعہ کی آبادی جس نے الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی-ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری (UPLC-HRMS) کا استعمال کرتے ہوئے عالمی سیرم میٹابولومکس تجزیہ کیا۔b مطالعہ کے گروپ سے 480 سیرم کے نمونوں کے کل میٹابولوم کا جزوی کم سے کم مربع امتیازی تجزیہ (PLS-DA)، بشمول صحت مند کنٹرول (HC, n = 174)، سومی نوڈولس (BN, n = 170)، اور مرحلہ I پھیپھڑوں کا اڈینو کارسینوما۔ (لاس اینجلس، این = 136)۔+ESI، مثبت الیکٹرو سپرے آئنائزیشن موڈ، -ESI، منفی الیکٹرو سپرے آئنائزیشن موڈ۔دو دیئے گئے گروپوں میں نمایاں طور پر مختلف کثرت کے ساتھ c–e میٹابولائٹس (دو دم ولکوکسن پر دستخط شدہ رینک ٹیسٹ، غلط دریافت کی شرح ایڈجسٹ شدہ پی ویلیو، FDR <0.05) سرخ (فولڈ چینج> 1.2) اور نیلے رنگ میں دکھائے گئے ہیں (فولڈ تبدیلی <0.83) .) آتش فشاں گرافک پر دکھایا گیا ہے۔f درجہ بندی کا کلسٹرنگ ہیٹ میپ LA اور BN کے درمیان تشریح شدہ میٹابولائٹس کی تعداد میں نمایاں فرق دکھا رہا ہے۔سورس ڈیٹا سورس ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
دریافت گروپ میں 174 HC، 170 BN اور 136 LA کے کل سیرم میٹابولوم کا تجزیہ UPLC-HRMS تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ہم سب سے پہلے یہ ظاہر کرتے ہیں کہ کوالٹی کنٹرول (QC) نمونے ایک غیر زیر نگرانی پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) ماڈل کے مرکز میں مضبوطی سے کلسٹر ہوتے ہیں، جو موجودہ مطالعے کی کارکردگی کے استحکام کی تصدیق کرتے ہیں (ضمنی شکل 2)۔
جیسا کہ شکل 1 b میں جزوی کم سے کم مربع امتیازی تجزیہ (PLS-DA) میں دکھایا گیا ہے، ہم نے پایا کہ LA اور BN، LA اور HC کے درمیان مثبت (+ESI) اور منفی (−ESI) الیکٹرو سپرے آئنائزیشن طریقوں میں واضح فرق موجود ہیں۔ .الگ تھلگتاہم، +ESI اور -ESI حالات میں BN اور HC کے درمیان کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔
ہم نے LA اور HC کے درمیان 382 امتیازی خصوصیات، LA اور BN کے درمیان 231 امتیازی خصوصیات، اور BN اور HC کے درمیان 95 امتیازی خصوصیات (Wilcoxon پر دستخط شدہ رینک ٹیسٹ، FDR <0.05 اور ایک سے زیادہ تبدیلی> 1.2 یا <0.83) (شکل .1c-e) )۔.چوٹیوں کو ڈیٹا بیس (mzCloud/HMDB/Chemspider لائبریری) کے خلاف m/z قدر، برقرار رکھنے کے وقت اور فریگمنٹیشن ماس سپیکٹرم کی تلاش (طریقوں کے سیکشن میں بیان کردہ تفصیلات) 22 کے ذریعے مزید تشریح (ضمنی ڈیٹا 3) کی گئی۔آخر میں، کثرت میں نمایاں فرق کے ساتھ 33 اور 38 تشریح شدہ میٹابولائٹس کی شناخت بالترتیب LA بمقابلہ BN (شکل 1f اور ضمنی جدول 2) اور LA بمقابلہ HC (ضمنی شکل 3 اور ضمنی جدول 2) کے لیے کی گئی۔اس کے برعکس، BN اور HC (ضمنی جدول 2) میں کثرت میں نمایاں فرق کے ساتھ صرف 3 میٹابولائٹس کی نشاندہی کی گئی، PLS-DA میں BN اور HC کے درمیان اوورلیپ کے مطابق۔یہ امتیازی میٹابولائٹس بائیو کیمیکلز کی ایک وسیع رینج کا احاطہ کرتے ہیں (ضمنی شکل 4)۔ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج سیرم میٹابولوم میں اہم تبدیلیوں کو ظاہر کرتے ہیں جو کہ پھیپھڑوں کے کینسر کے ابتدائی مرحلے میں مہلک تبدیلی کی عکاسی کرتے ہیں سومی پھیپھڑوں کے نوڈولس یا صحت مند مضامین کے مقابلے میں۔دریں اثنا، BN اور HC کے سیرم میٹابولوم کی مماثلت بتاتی ہے کہ سومی پلمونری نوڈولس صحت مند افراد کے ساتھ بہت سی حیاتیاتی خصوصیات کا اشتراک کر سکتے ہیں۔یہ دیکھتے ہوئے کہ ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر ریسیپٹر (EGFR) جین اتپریورتن پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما ذیلی قسم 23 میں عام ہیں، ہم نے سیرم میٹابولوم پر ڈرائیور تغیرات کے اثرات کا تعین کرنے کی کوشش کی۔اس کے بعد ہم نے پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما گروپ میں ای جی ایف آر کی حیثیت کے ساتھ 72 کیسوں کے مجموعی میٹابولومک پروفائل کا تجزیہ کیا۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ہمیں PCA تجزیہ (ضمنی شکل 5a) میں EGFR اتپریورتی مریضوں (n = 41) اور EGFR جنگلی قسم کے مریضوں (n = 31) کے درمیان موازنہ پروفائلز ملے۔تاہم، ہم نے 7 میٹابولائٹس کی نشاندہی کی جن کی کثرت EGFR اتپریورتن والے مریضوں میں جنگلی قسم کے EGFR (t ٹیسٹ، p <0.05 اور فولڈ چینج> 1.2 یا <0.83) کے مقابلے میں نمایاں طور پر تبدیل ہوئی تھی (ضمنی شکل 5b)۔ان میٹابولائٹس کی اکثریت (7 میں سے 5) acylcarnitines ہیں، جو فیٹی ایسڈ آکسیکرن کے راستوں میں اہم کردار ادا کرتی ہیں۔
جیسا کہ شکل 2 a میں دکھائے گئے ورک فلو میں دکھایا گیا ہے، نوڈول کی درجہ بندی کے لیے بائیو مارکر کم از کم مطلق سکڑنے والے آپریٹرز کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیے گئے تھے اور LA (n = 136) اور BN (n = 170) میں شناخت شدہ 33 تفریق میٹابولائٹس کی بنیاد پر انتخاب کیا گیا تھا۔متغیرات کا بہترین مجموعہ (LASSO) - بائنری لاجسٹک ریگریشن ماڈل۔ماڈل کی وشوسنییتا کو جانچنے کے لیے دس گنا کراس توثیق کا استعمال کیا گیا۔متغیر انتخاب اور پیرامیٹر ریگولرائزیشن کو پیرامیٹر λ24 کے ساتھ امکانی زیادہ سے زیادہ سزا کے ذریعے ایڈجسٹ کیا جاتا ہے۔عالمی میٹابولومکس تجزیہ مزید آزادانہ طور پر اندرونی توثیق (n = 104) اور بیرونی توثیق (n = 111) گروپوں میں امتیازی ماڈل کی درجہ بندی کی کارکردگی کو جانچنے کے لیے انجام دیا گیا۔نتیجے کے طور پر، دریافت سیٹ میں 27 میٹابولائٹس کی سب سے بڑی اوسط AUC قدر (تصویر 2b) کے ساتھ بہترین امتیازی ماڈل کے طور پر شناخت کی گئی، جن میں سے 9 کی سرگرمی میں اضافہ ہوا اور 18 نے BN (تصویر 2c) کے مقابلے LA میں سرگرمی میں کمی کی۔
پلمونری نوڈول کلاسیفائر بنانے کے لیے ورک فلو، بشمول دس گنا کراس توثیق کے ذریعے بائنری لاجسٹک ریگریشن ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے دریافت سیٹ میں سیرم میٹابولائٹس کے بہترین پینل کو منتخب کرنا اور اندرونی اور بیرونی توثیق کے سیٹوں میں پیش گوئی کی کارکردگی کا جائزہ لینا۔b میٹابولک بائیو مارکر کے انتخاب کے لیے LASSO ریگریشن ماڈل کے کراس توثیق کے اعدادوشمار۔اوپر دیے گئے نمبر دیے گئے λ میں منتخب بائیو مارکر کی اوسط تعداد کی نمائندگی کرتے ہیں۔سرخ نقطے والی لائن متعلقہ لیمبڈا پر اوسط AUC قدر کی نمائندگی کرتی ہے۔گرے ایرر بارز کم سے کم اور زیادہ سے زیادہ AUC اقدار کی نمائندگی کرتے ہیں۔نقطے والی لائن 27 منتخب بائیو مارکر کے ساتھ بہترین ماڈل کی نشاندہی کرتی ہے۔AUC، وصول کنندہ آپریٹنگ خصوصیت (ROC) وکر کے تحت علاقہ۔c دریافت گروپ میں بی این گروپ کے مقابلے ایل اے گروپ میں 27 منتخب میٹابولائٹس کی تبدیلیاں۔سرخ کالم - ایکٹیویشن۔نیلا کالم ایک زوال ہے۔d–f وصول کنندہ آپریٹنگ خصوصیت (ROC) کے منحنی خطوط جو دریافت، اندرونی اور بیرونی توثیق کے سیٹوں میں 27 میٹابولائٹ امتزاج پر مبنی امتیازی ماڈل کی طاقت کو ظاہر کرتے ہیں۔سورس ڈیٹا سورس ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
ان 27 میٹابولائٹس (ضمنی جدول 3) کے وزنی ریگریشن گتانک کی بنیاد پر ایک پیشن گوئی ماڈل بنایا گیا تھا۔ان 27 میٹابولائٹس پر مبنی آر او سی تجزیہ نے 0.933 کی وکر (AUC) ویلیو کے نیچے ایک علاقہ حاصل کیا، دریافت گروپ کی حساسیت 0.868 تھی، اور مخصوصیت 0.859 تھی (تصویر 2d)۔دریں اثنا، LA اور HC کے درمیان 38 تشریح شدہ تفریق میٹابولائٹس میں سے، 16 میٹابولائٹس کے ایک سیٹ نے 0.801 کی حساسیت کے ساتھ 0.902 کا AUC حاصل کیا اور LA سے امتیازی سلوک میں 0.856 کی خصوصیت HC (ضمنی شکل 6a-c) سے حاصل کی۔تفریق میٹابولائٹس کے لیے مختلف فولڈ چینج تھریشولڈز پر مبنی AUC اقدار کا بھی موازنہ کیا گیا۔ہم نے پایا کہ درجہ بندی کے ماڈل نے LA اور BN (HC) کے درمیان امتیاز کرنے میں بہترین کارکردگی کا مظاہرہ کیا جب فولڈ تبدیلی کی سطح 1.2 بمقابلہ 1.5 یا 2.0 پر سیٹ کی گئی تھی (ضمنی شکل 7a، b)۔27 میٹابولائٹ گروپس پر مبنی درجہ بندی کے ماڈل کو اندرونی اور بیرونی گروہوں میں مزید درست کیا گیا۔AUC اندرونی توثیق کے لیے 0.915 (حساسیت 0.867، مخصوصیت 0.811) اور بیرونی توثیق کے لیے 0.945 (حساسیت 0.810، مخصوصیت 0.979) تھی (تصویر 2e، f)۔بین لیبارٹری کی کارکردگی کا اندازہ لگانے کے لیے، بیرونی کوہورٹ کے 40 نمونوں کا ایک بیرونی لیبارٹری میں تجزیہ کیا گیا جیسا کہ طریقوں کے سیکشن میں بیان کیا گیا ہے۔درجہ بندی کی درستگی نے 0.925 کا AUC حاصل کیا (ضمنی شکل 8)۔چونکہ پھیپھڑوں کے اسکواومس سیل کارسنوما (LUSC) پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما (LUAD) کے بعد نان سمال سیل پھیپھڑوں کے کینسر (NSCLC) کی دوسری سب سے عام ذیلی قسم ہے، اس لیے ہم نے میٹابولک پروفائلز کی توثیق شدہ ممکنہ افادیت کا بھی تجربہ کیا۔بی این اور LUSC کے 16 کیسز۔LUSC اور BN کے درمیان امتیازی سلوک کا AUC 0.776 تھا (ضمنی شکل 9)، جو کہ LUAD اور BN کے درمیان امتیازی سلوک کے مقابلے میں کمزور صلاحیت کی نشاندہی کرتا ہے۔
مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ سی ٹی امیجز پر نوڈولس کا سائز بدکاری کے امکان کے ساتھ مثبت طور پر منسلک ہوتا ہے اور نوڈول کے علاج کا ایک اہم عامل رہتا ہے 25,26,27۔NELSON اسکریننگ اسٹڈی کے بڑے گروپ کے اعداد و شمار کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ نوڈس <5 ملی میٹر والے مضامین میں مہلکیت کا خطرہ نوڈس 28 کے بغیر مضامین میں بھی اسی طرح کا تھا۔لہذا، برٹش تھوراسک سوسائٹی (BTS) کے ذریعہ تجویز کردہ کم از کم سائز 5 ملی میٹر ہے، جیسا کہ CT مانیٹرنگ کی ضرورت ہے، اور Fleischner Society 29 کی تجویز کے مطابق 6 ملی میٹر ہے۔تاہم، 6 ملی میٹر سے بڑے اور واضح سومی خصوصیات کے بغیر، غیر معینہ پلمونری نوڈولس (IPN) کہلاتے ہیں، کلینیکل پریکٹس30,31 میں تشخیص اور انتظام میں ایک بڑا چیلنج بنے ہوئے ہیں۔ہم نے اگلی بار جانچ کی کہ آیا دریافت اور داخلی توثیق کے گروہوں سے جمع شدہ نمونوں کا استعمال کرتے ہوئے نوڈول سائز نے میٹابولومک دستخطوں کو متاثر کیا۔27 توثیق شدہ بائیو مارکر پر توجہ مرکوز کرتے ہوئے، ہم نے سب سے پہلے HC اور BN ذیلی 6 ملی میٹر میٹابولوم کے پی سی اے پروفائلز کا موازنہ کیا۔ہم نے پایا کہ HC اور BN کے زیادہ تر ڈیٹا پوائنٹس اوورلیپ ہو گئے ہیں، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ دونوں گروپوں میں سیرم میٹابولائٹ کی سطح ایک جیسی تھی (تصویر 3a)۔مختلف سائز کی حدود میں خصوصیت کے نقشے BN اور LA (تصویر 3b، c) میں محفوظ رہے، جبکہ 6–20 ملی میٹر رینج (تصویر 3d) میں مہلک اور سومی نوڈولس کے درمیان علیحدگی دیکھی گئی۔اس گروہ میں 0.927 کا AUC، 0.868 کی مخصوصیت، اور 0.820 کی حساسیت 6 سے 20 ملی میٹر (تصویر 3e، f) کی پیمائش کے نوڈولس کی خرابی کی پیش گوئی کرنے کے لیے تھی۔ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ درجہ بندی کرنے والا ابتدائی مہلک تبدیلی کی وجہ سے ہونے والی میٹابولک تبدیلیوں کو گرفت میں لے سکتا ہے، چاہے نوڈول سائز سے قطع نظر۔
27 میٹابولائٹس کے میٹابولک درجہ بندی کی بنیاد پر مخصوص گروپوں کے درمیان PCA پروفائلز کا موازنہ۔CC اور BN <6 ملی میٹر۔b BN <6 mm بمقابلہ BN 6–20 mm۔LA میں 6–20 mm بمقابلہ LA 20–30 mm۔g BN 6–20 mm اور LA 6–20 mm۔جی سی، این = 174;بی این <6 ملی میٹر، این = 153؛BN 6–20 mm, n = 91;LA 6–20 mm, n = 89;LA 20–30 mm, n = 77. e وصول کنندہ آپریٹنگ خصوصیت (ROC) وکر جو 6–20 mm نوڈولس کے لیے امتیازی ماڈل کی کارکردگی دکھا رہا ہے۔f امکانی اقدار کا حساب 6-20 ملی میٹر کے نوڈولس کے لاجسٹک ریگریشن ماڈل کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔گرے ڈاٹڈ لائن بہترین کٹ آف ویلیو (0.455) کی نمائندگی کرتی ہے۔اوپر دیے گئے نمبر لاس اینجلس کے لیے پیش کیے گئے کیسز کے فیصد کی نمائندگی کرتے ہیں۔دو دم والا طالب علم کا ٹی ٹیسٹ استعمال کریں۔پی سی اے، پرنسپل جزو تجزیہ۔وکر کے نیچے AUC کا علاقہ۔سورس ڈیٹا سورس ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
اسی طرح کے پلمونری نوڈول سائز (7–9 ملی میٹر) کے ساتھ چار نمونے (عمر 44-61 سال) مجوزہ مہلک پیش گوئی کے ماڈل (تصویر 4a، b) کی کارکردگی کو واضح کرنے کے لیے مزید منتخب کیے گئے۔ابتدائی اسکریننگ پر، کیس 1 کو کیلسیفیکیشن کے ساتھ ایک ٹھوس نوڈول کے طور پر پیش کیا گیا، یہ ایک خصوصیت سومی سے منسلک ہے، جب کہ کیس 2 کو ایک غیر متعین جزوی طور پر ٹھوس نوڈول کے طور پر پیش کیا گیا جس میں کوئی واضح خصوصیات نہیں ہیں۔فالو اپ سی ٹی اسکینز کے تین راؤنڈز نے ظاہر کیا کہ یہ کیسز 4 سال کی مدت میں مستحکم رہے اور اس لیے انہیں بے نظیر نوڈولس (تصویر 4a) سمجھا گیا۔سیریل سی ٹی اسکینز کی طبی تشخیص کے مقابلے میں، موجودہ درجہ بندی کرنے والے ماڈل کے ساتھ سنگل شاٹ سیرم میٹابولائٹ تجزیہ نے امکانی رکاوٹوں (ٹیبل 1) کی بنیاد پر ان سومی نوڈولس کو تیزی سے اور درست طریقے سے شناخت کیا۔صورت 3 میں شکل 4b ایک نوڈول کو ظاہر کرتا ہے جس میں فوففس سے دستبرداری کی علامات ہوتی ہیں، جو زیادہ تر مہلکیت 32 سے منسلک ہوتی ہے۔کیس 4 ایک غیر متعین جزوی طور پر ٹھوس نوڈول کے طور پر پیش کیا گیا جس میں سومی وجہ کا کوئی ثبوت نہیں ہے۔درجہ بندی کرنے والے ماڈل (ٹیبل 1) کے مطابق ان تمام معاملات کی مہلک ہونے کی پیش گوئی کی گئی تھی۔پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کی تشخیص پھیپھڑوں کی ریسیکشن سرجری (تصویر 4b) کے بعد ہسٹوپیتھولوجیکل امتحان کے ذریعہ ظاہر کی گئی تھی۔خارجی توثیق کے سیٹ کے لیے، میٹابولک درجہ بندی کرنے والے نے 6 ملی میٹر (ضمنی شکل 10) سے بڑے پھیپھڑوں کے نوڈولس کے دو کیسز کی درست پیش گوئی کی۔
سومی نوڈولس کے دو کیسز کے پھیپھڑوں کی محوری کھڑکی کی CT تصاویر۔کیس 1 میں، 4 سال کے بعد CT اسکین نے ایک مستحکم ٹھوس نوڈول دکھایا جس کی پیمائش 7 ملی میٹر دائیں نچلے حصے میں کیلسیفیکیشن کے ساتھ تھی۔کیس 2 میں، 5 سال کے بعد CT سکین نے دائیں اوپری لاب میں 7 ملی میٹر قطر کے ساتھ ایک مستحکم، جزوی طور پر ٹھوس نوڈول کا انکشاف کیا۔b پھیپھڑوں کی محوری ونڈو سی ٹی امیجز اور پھیپھڑوں کے ریسیکشن سے پہلے اسٹیج I اڈینو کارسینوما کے دو کیسوں کے متعلقہ پیتھولوجیکل اسٹڈیز۔کیس 3 نے ایک نوڈول کا انکشاف کیا جس کا قطر 8 ملی میٹر کے ساتھ دائیں اوپری لاب میں پلورل ریٹریکشن کے ساتھ تھا۔کیس 4 نے بائیں اوپری لاب میں 9 ملی میٹر کی پیمائش کرنے والے جزوی طور پر ٹھوس زمینی شیشے کے نوڈول کا انکشاف کیا۔ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) پھیپھڑوں کے ٹشو (اسکیل بار = 50 μm) کا داغ لگانا پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کے ایکنار نمو کا مظاہرہ کرتا ہے۔تیر سی ٹی امیجز پر پائے جانے والے نوڈولس کی نشاندہی کرتے ہیں۔H&E امیجز متعدد (>3) خوردبینی شعبوں کی نمائندہ تصاویر ہیں جن کا پیتھالوجسٹ کے ذریعے معائنہ کیا جاتا ہے۔
ایک ساتھ مل کر، ہمارے نتائج پلمونری نوڈولس کی تفریق تشخیص میں سیرم میٹابولائٹ بائیو مارکر کی ممکنہ قدر کو ظاہر کرتے ہیں، جو سی ٹی اسکریننگ کا جائزہ لیتے وقت چیلنجز پیش کر سکتے ہیں۔
ایک توثیق شدہ تفریق میٹابولائٹ پینل کی بنیاد پر، ہم نے بڑی میٹابولک تبدیلیوں کے حیاتیاتی ارتباط کی نشاندہی کرنے کی کوشش کی۔MetaboAnalyst کے KEGG پاتھ وے افزودگی کے تجزیے نے دو دیے گئے گروپوں (LA بمقابلہ HC اور LA بمقابلہ BN، ایڈجسٹڈ p ≤ 0.001، اثر > 0.01) کے درمیان 6 عام نمایاں طور پر تبدیل شدہ راستوں کی نشاندہی کی۔یہ تبدیلیاں پائروویٹ میٹابولزم، ٹرپٹوفن میٹابولزم، نیاسین اور نیکوٹینامائڈ میٹابولزم، گلائکولیسس، ٹی سی اے سائیکل، اور پیورین میٹابولزم (تصویر 5 اے) میں خلل کے ساتھ نمایاں تھیں۔اس کے بعد ہم نے مطلق مقدار کا استعمال کرتے ہوئے بڑی تبدیلیوں کی تصدیق کرنے کے لئے ہدف شدہ میٹابولومکس کا مظاہرہ کیا۔مستند میٹابولائٹ معیارات کا استعمال کرتے ہوئے ٹرپل کواڈروپول ماس اسپیکٹومیٹری (QQQ) کے ذریعے عام طور پر تبدیل شدہ راستوں میں عام میٹابولائٹس کا تعین۔میٹابولومکس اسٹڈی کے ہدف کے نمونے کی آبادیاتی خصوصیات کو ضمنی جدول 4 میں شامل کیا گیا ہے۔ ہمارے عالمی میٹابولومکس کے نتائج سے ہم آہنگ، مقداری تجزیہ نے اس بات کی تصدیق کی ہے کہ بی این اور ایچ سی کے مقابلے ایل اے میں ہائپوکسینتھائن اور زانتھائن، پائروویٹ اور لییکٹیٹ میں اضافہ ہوا ہے۔ p <0.05)۔تاہم، BN اور HC کے درمیان ان میٹابولائٹس میں کوئی خاص فرق نہیں پایا گیا۔
BN اور HC گروپس کے مقابلے LA گروپ میں نمایاں طور پر مختلف میٹابولائٹس کا KEGG پاتھ وے افزودگی کا تجزیہ۔ایک دو دم والا گلوبلٹیسٹ استعمال کیا گیا تھا، اور p اقدار کو Holm-Bonferroni طریقہ (ایڈجسٹڈ p ≤ 0.001 اور اثر کا سائز> 0.01) استعمال کرتے ہوئے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔b–d وائلن پلاٹ جو سیرم HC، BN، اور LA میں ہائپوکسینتھائن، xanthine، lactate، pyruvate، اور tryptophan کی سطح کو ظاہر کرتے ہیں جو LC-MS/MS (n = 70 فی گروپ) کے ذریعے طے کیا جاتا ہے۔سفید اور سیاہ نقطے والی لکیریں بالترتیب درمیانی اور چوتھائی کی نشاندہی کرتی ہیں۔e وائلن پلاٹ LUAD-TCGA ڈیٹاسیٹ میں عام پھیپھڑوں کے ٹشو (n = 59) کے مقابلے پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما (n = 513) میں SLC7A5 اور QPRT کا نارملائزڈ Log2TPM (ٹرانسکرپٹس فی ملین) mRNA اظہار دکھا رہا ہے۔سفید باکس انٹرکوارٹائل رینج کی نمائندگی کرتا ہے، درمیان میں افقی سیاہ لائن درمیانی کی نمائندگی کرتی ہے، اور عمودی سیاہ لائن باکس سے پھیلی ہوئی 95٪ اعتماد کے وقفے (CI) کی نمائندگی کرتی ہے۔TCGA ڈیٹاسیٹ میں پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما (n = 513) اور عام پھیپھڑوں کے ٹشو (n = 59) میں SLC7A5 اور GAPDH اظہار کا پیئرسن کا ارتباطی پلاٹ۔گرے ایریا 95% CI کی نمائندگی کرتا ہے۔r، پیئرسن کے ارتباط کا گتانک۔LC-MS/MS کے ذریعے طے شدہ غیر مخصوص shRNA کنٹرول (NC) اور shSLC7A5 (Sh1, Sh2) سے تبدیل شدہ A549 خلیوں میں سیلولر ٹرپٹوفن کی سطح کو معمول پر لایا گیا۔ہر گروپ میں پانچ حیاتیاتی طور پر آزاد نمونوں کا شماریاتی تجزیہ پیش کیا گیا ہے۔h A549 سیلز (NC) اور SLC7A5 ناک ڈاؤن A549 سیلز (Sh1, Sh2) میں NADt کی سیلولر لیول (کل NAD، بشمول NAD+ اور NADH)۔ہر گروپ میں تین حیاتیاتی طور پر آزاد نمونوں کا شماریاتی تجزیہ پیش کیا گیا ہے۔i SLC7A5 دستک ڈاؤن سے پہلے اور بعد میں A549 خلیوں کی Glycolytic سرگرمی کو ایکسٹرا سیلولر تیزابیت کی شرح (ECAR) (n = 4 فی گروپ حیاتیاتی طور پر آزاد نمونے) سے ماپا گیا۔2-DG، 2-deoxy-D-گلوکوز۔دو دم والے طالب علم کا ٹی ٹیسٹ (b–h) میں استعمال کیا گیا تھا۔(g–i) میں، ایرر بارز اوسط ± SD کی نمائندگی کرتے ہیں، ہر تجربہ تین بار آزادانہ طور پر کیا گیا تھا اور نتائج ایک جیسے تھے۔سورس ڈیٹا سورس ڈیٹا فائلوں کی شکل میں فراہم کیا جاتا ہے۔
ایل اے گروپ میں تبدیل شدہ ٹرپٹوفن میٹابولزم کے اہم اثرات پر غور کرتے ہوئے، ہم نے QQQ کا استعمال کرتے ہوئے HC، BN، اور LA گروپوں میں سیرم ٹرپٹوفن کی سطح کا بھی اندازہ کیا۔ہم نے پایا کہ سیرم ٹرپٹوفن ایل اے میں ایچ سی یا بی این (پی <0.001، شکل 5 ڈی) کے مقابلے میں کم ہوا تھا، جو پچھلے نتائج سے مطابقت رکھتا ہے کہ پھیپھڑوں کے کینسر کے مریضوں میں گردش کرنے والی ٹرپٹوفن کی سطح کنٹرول گروپ کے صحت مند کنٹرولوں کے مقابلے میں کم ہوتی ہے۔ ,35.PET/CT ٹریسر 11C-methyl-L-tryptophan کا استعمال کرتے ہوئے ایک اور مطالعہ نے پایا کہ پھیپھڑوں کے کینسر کے ٹشو میں ٹرپٹوفن سگنل برقرار رکھنے کا وقت سومی گھاووں یا نارمل ٹشو36 کے مقابلے میں نمایاں طور پر بڑھا تھا۔ہم قیاس کرتے ہیں کہ ایل اے سیرم میں ٹرپٹوفن میں کمی پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں کے ذریعہ فعال ٹرپٹوفن کی مقدار کی عکاسی کر سکتی ہے۔
یہ بھی جانا جاتا ہے کہ ٹرپٹوفن کیٹابولزم کے کائنورینائن پاتھ وے کی آخری پیداوار NAD+37,38 ہے، جو گلائکولیسس39 میں 1,3-bisphosphoglycerate کے ساتھ glyceraldehyde-3-phosphate کے رد عمل کے لیے ایک اہم ذیلی جگہ ہے۔اگرچہ پچھلے مطالعات نے مدافعتی ضابطے میں ٹرپٹوفن کیٹابولزم کے کردار پر توجہ مرکوز کی ہے، ہم نے موجودہ مطالعے میں مشاہدہ کردہ ٹرپٹوفن ڈیسرگولیشن اور گلائکولٹک راستوں کے مابین تعامل کو واضح کرنے کی کوشش کی۔سولوٹ ٹرانسپورٹر فیملی 7 ممبر 5 (SLC7A5) کو ٹرپٹوفن ٹرانسپورٹر 43,44,45 کہا جاتا ہے۔Quinolinic acid phosphoribosyltransferase (QPRT) ایک انزائم ہے جو کینورینائن پاتھ وے کے نیچے کی طرف واقع ہے جو کوئنولینک ایسڈ کو NAMN46 میں تبدیل کرتا ہے۔LUAD TCGA ڈیٹاسیٹ کے معائنے سے یہ بات سامنے آئی کہ SLC7A5 اور QPRT دونوں ٹیومر ٹشو میں عام ٹشو (تصویر 5e) کے مقابلے میں نمایاں طور پر اپ ریگولیٹ تھے۔یہ اضافہ مراحل I اور II کے ساتھ ساتھ پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما (ضمنی شکل 11) کے مراحل III اور IV میں دیکھا گیا، جو ٹیومرجینیسیس سے وابستہ ٹرپٹوفن میٹابولزم میں ابتدائی خلل کی نشاندہی کرتا ہے۔
مزید برآں، LUAD-TCGA ڈیٹاسیٹ نے کینسر کے مریضوں کے نمونوں میں SLC7A5 اور GAPDH mRNA اظہار کے درمیان ایک مثبت ارتباط ظاہر کیا (r = 0.45، p = 1.55E-26، شکل 5f)۔اس کے برعکس، عام پھیپھڑوں کے ٹشو (r = 0.25، p = 0.06، شکل 5f) میں اس طرح کے جین کے دستخطوں کے درمیان کوئی اہم ارتباط نہیں پایا گیا۔A549 خلیوں میں SLC7A5 (ضمنی اعداد و شمار 12) کے دستک نے سیلولر ٹرپٹوفن اور NAD(H) کی سطح (فگر 5g,h) کو نمایاں طور پر کم کیا، جس کے نتیجے میں ایکسٹرا سیلولر تیزابیت کی شرح (ECAR) (شکل 1) سے ماپا جانے والی گلائکولٹک سرگرمی میں کمی واقع ہوئی۔5i)۔اس طرح، سیرم میں میٹابولک تبدیلیوں اور وٹرو کا پتہ لگانے کی بنیاد پر، ہم یہ قیاس کرتے ہیں کہ ٹرپٹوفن میٹابولزم کائنورین پاتھ وے کے ذریعے NAD+ پیدا کر سکتا ہے اور پھیپھڑوں کے کینسر میں گلائکولائسز کو فروغ دینے میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔
مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ LDCT کے ذریعے پائے جانے والے غیر متعین پلمونری نوڈولز کی ایک بڑی تعداد اضافی جانچ کی ضرورت کا باعث بن سکتی ہے جیسے PET-CT، پھیپھڑوں کی بایپسی، اور خرابی کی غلط مثبت تشخیص کی وجہ سے زیادہ علاج۔ 31 جیسا کہ شکل 6 میں دکھایا گیا ہے، ہمارے مطالعہ نے ممکنہ تشخیصی قدر کے ساتھ سیرم میٹابولائٹس کے ایک پینل کی نشاندہی کی ہے جو خطرے کی سطح کو بہتر بنا سکتا ہے اور CT کے ذریعہ پائے جانے والے پلمونری نوڈولس کے بعد کے انتظام کو بہتر بنا سکتا ہے۔
پلمونری نوڈولس کا اندازہ کم خوراک کمپیوٹڈ ٹوموگرافی (LDCT) کے ساتھ کیا جاتا ہے جس میں امیجنگ کی خصوصیات سومی یا مہلک وجوہات کی نشاندہی کرتی ہیں۔نوڈولس کا غیر یقینی نتیجہ بار بار فالو اپ وزٹ، غیر ضروری مداخلتوں اور ضرورت سے زیادہ علاج کا باعث بن سکتا ہے۔تشخیصی قدر کے ساتھ سیرم میٹابولک کلاسیفائر کی شمولیت خطرے کی تشخیص اور پلمونری نوڈولس کے بعد کے انتظام کو بہتر بنا سکتی ہے۔پی ای ٹی پوزیٹرون ایمیشن ٹوموگرافی۔
US NLST مطالعہ اور یورپی NELSON مطالعہ کے اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ کم خوراک کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی (LDCT) کے ساتھ ہائی رسک گروپس کی اسکریننگ پھیپھڑوں کے کینسر سے ہونے والی اموات 1,3 کو کم کر سکتی ہے۔تاہم، خطرے کی تشخیص اور بعد میں LDCT کے ذریعے پائے جانے والے واقعاتی پلمونری نوڈولس کی بڑی تعداد کا طبی انتظام سب سے زیادہ چیلنجنگ ہے۔اہم مقصد قابل اعتماد بائیو مارکرز کو شامل کرکے موجودہ LDCT پر مبنی پروٹوکولز کی درست درجہ بندی کو بہتر بنانا ہے۔
بعض مالیکیولر بائیو مارکر، جیسے کہ بلڈ میٹابولائٹس، کی شناخت پھیپھڑوں کے کینسر کا صحت مند کنٹرولوں سے موازنہ کرکے کی گئی ہے 15,17۔موجودہ مطالعہ میں، ہم نے سیرم میٹابولومکس تجزیہ کے اطلاق پر توجہ مرکوز کی تاکہ LDCT کے ذریعے اتفاقی طور پر پائے جانے والے سومی اور مہلک پلمونری نوڈولس کے درمیان فرق کیا جا سکے۔ہم نے UPLC-HRMS تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے صحت مند کنٹرول (HC) کے عالمی سیرم میٹابولوم، سومی پھیپھڑوں کے نوڈولس (BN)، اور مرحلہ I پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما (LA) کے نمونوں کا موازنہ کیا۔ہم نے پایا کہ HC اور BN میں ایک جیسے میٹابولک پروفائلز تھے، جبکہ LA نے HC اور BN کے مقابلے میں نمایاں تبدیلیاں دکھائیں۔ہم نے سیرم میٹابولائٹس کے دو سیٹوں کی نشاندہی کی جو LA کو HC اور BN سے ممتاز کرتے ہیں۔
سومی اور مہلک نوڈولس کے لیے موجودہ LDCT پر مبنی شناختی اسکیم بنیادی طور پر 30 کے ساتھ ساتھ نوڈولس کے سائز، کثافت، شکل اور ترقی کی شرح پر مبنی ہے۔پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ نوڈولس کے سائز کا پھیپھڑوں کے کینسر کے امکان سے گہرا تعلق ہے۔یہاں تک کہ زیادہ خطرہ والے مریضوں میں، نوڈس <6 ملی میٹر میں خرابی کا خطرہ <1٪ ہے۔6 سے 20 ملی میٹر کے نوڈولس کے لیے مہلکیت کا خطرہ 8% سے 64%30 تک ہوتا ہے۔لہذا، فلیشنر سوسائٹی روٹین سی ٹی فالو اپ کے لیے 6 ملی میٹر کے کٹ آف قطر کی سفارش کرتی ہے۔29 تاہم، 6 ملی میٹر سے بڑے غیر مقررہ پلمونری نوڈولس (IPN) کے خطرے کی تشخیص اور انتظام کو مناسب طریقے سے انجام نہیں دیا گیا ہے۔پیدائشی دل کی بیماری کا موجودہ انتظام عام طور پر بار بار سی ٹی کی نگرانی کے ساتھ چوکس انتظار پر مبنی ہوتا ہے۔
توثیق شدہ میٹابولوم کی بنیاد پر، ہم نے پہلی بار صحت مند افراد اور سومی نوڈولس <6 ملی میٹر کے درمیان میٹابولومک دستخطوں کے اوورلیپ کا مظاہرہ کیا۔حیاتیاتی مماثلت پچھلے سی ٹی کے نتائج سے مطابقت رکھتی ہے کہ نوڈولس <6 ملی میٹر کے لیے مہلک پن کا خطرہ اتنا ہی کم ہے جتنا کہ نوڈس کے بغیر مضامین کے لیے۔ 30 واضح رہے کہ ہمارے نتائج یہ بھی ظاہر کرتے ہیں کہ سومی نوڈولس <6 ملی میٹر اور ≥6 ملی میٹر زیادہ ہوتے ہیں۔ میٹابولومک پروفائلز میں مماثلت، یہ تجویز کرتی ہے کہ سومی ایٹولوجی کی فنکشنل تعریف نوڈول سائز سے قطع نظر مطابقت رکھتی ہے۔اس طرح، جدید تشخیصی سیرم میٹابولائٹ پینلز قاعدہ سے باہر ٹیسٹ کے طور پر ایک واحد پرکھ فراہم کر سکتے ہیں جب ابتدائی طور پر CT پر نوڈولس کا پتہ چل جاتا ہے اور ممکنہ طور پر سیریل مانیٹرنگ کو کم کر دیتے ہیں۔ایک ہی وقت میں، میٹابولک بائیو مارکرز کے اسی پینل نے مہلک نوڈولس ≥6 ملی میٹر سائز کو سومی نوڈولس سے ممتاز کیا اور اسی طرح کے سائز کے IPNs اور CT امیجز پر مبہم مورفولوجیکل خصوصیات کے لیے درست پیشین گوئیاں فراہم کیں۔اس سیرم میٹابولزم کے درجہ بندی نے 0.927 کے AUC کے ساتھ نوڈولس ≥6 ملی میٹر کی خرابی کی پیش گوئی کرنے میں اچھی کارکردگی کا مظاہرہ کیا۔ایک ساتھ مل کر، ہمارے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ منفرد سیرم میٹابولومک دستخط خاص طور پر ابتدائی ٹیومر کی حوصلہ افزائی میٹابولک تبدیلیوں کی عکاسی کر سکتے ہیں اور خطرے کے پیش گو کے طور پر ممکنہ قدر رکھتے ہیں، نوڈول سائز سے آزاد۔
خاص طور پر، پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما (LUAD) اور squamous cell carcinoma (LUSC) غیر چھوٹے سیل پھیپھڑوں کے کینسر (NSCLC) کی اہم اقسام ہیں۔یہ دیکھتے ہوئے کہ LUSC تمباکو کے استعمال سے مضبوطی سے وابستہ ہے 47 اور LUAD CT اسکریننگ48 پر پائے جانے والے واقعاتی پھیپھڑوں کے نوڈولس کی سب سے عام ہسٹولوجی ہے، ہمارا درجہ بندی ماڈل خاص طور پر اسٹیج I اڈینو کارسینوما کے نمونوں کے لیے بنایا گیا تھا۔وانگ اور ساتھیوں نے LUAD پر بھی توجہ مرکوز کی اور صحت مند افراد سے ابتدائی مرحلے کے پھیپھڑوں کے کینسر میں فرق کرنے کے لیے لپڈومکس کا استعمال کرتے ہوئے نو لپڈ دستخطوں کی نشاندہی کی۔ہم نے موجودہ درجہ بندی ماڈل کا اسٹیج I LUSC کے 16 کیسز اور 74 سومی نوڈولس پر تجربہ کیا اور کم LUSC پیشین گوئی کی درستگی (AUC 0.776) کا مشاہدہ کیا، یہ تجویز کیا کہ LUAD اور LUSC کے اپنے میٹابولومک دستخط ہو سکتے ہیں۔درحقیقت، LUAD اور LUSC کو ایٹولوجی، حیاتیاتی اصل اور جینیاتی خرابیوں میں فرق دکھایا گیا ہے۔لہذا، اسکریننگ پروگراموں میں پھیپھڑوں کے کینسر کی آبادی کی بنیاد پر پتہ لگانے کے لیے تربیتی ماڈلز میں ہسٹولوجی کی دیگر اقسام کو شامل کیا جانا چاہیے۔
یہاں، ہم نے صحت مند کنٹرول اور سومی نوڈولس کے مقابلے پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما میں اکثر تبدیل ہونے والے چھ راستوں کی نشاندہی کی۔Xanthine اور hypoxanthine پیورین میٹابولک راستے کے عام میٹابولائٹس ہیں۔ہمارے نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، پیورین میٹابولزم سے وابستہ انٹرمیڈیٹس میں صحت مند کنٹرولوں کے مقابلے میں پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کے مریضوں کے سیرم یا ٹشوز میں نمایاں طور پر اضافہ کیا گیا تھا یا پہلے سے 15,50 مرحلے کے مریضوں کے مقابلے میں۔بلند سیرم زانتھائن اور ہائپوکسینتھائن کی سطح کینسر کے خلیوں کو تیزی سے پھیلانے کے لیے درکار انابولزم کی عکاسی کر سکتی ہے۔گلوکوز میٹابولزم کی بے ضابطگی کینسر میٹابولزم کی ایک معروف پہچان ہے۔یہاں، ہم نے ایچ سی اور بی این گروپ کے مقابلے ایل اے گروپ میں پائروویٹ اور لییکٹیٹ میں نمایاں اضافہ دیکھا، جو کہ نان سمال سیل پھیپھڑوں کے کینسر (این ایس سی ایل سی) کے سیرم میٹابولوم پروفائلز میں گلائکولٹک پاتھ وے کی اسامانیتاوں کی پچھلی رپورٹس کے مطابق ہے۔ صحت مند کنٹرول.نتائج 52,53 برابر ہیں۔
اہم بات یہ ہے کہ ہم نے پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوماس کے سیرم میں پائروویٹ اور ٹرپٹوفن میٹابولزم کے درمیان الٹا تعلق دیکھا۔ایچ سی یا بی این گروپ کے مقابلے ایل اے گروپ میں سیرم ٹرپٹوفن کی سطح کو کم کیا گیا تھا۔دلچسپ بات یہ ہے کہ ایک ممکنہ گروہ کا استعمال کرتے ہوئے پچھلے بڑے پیمانے پر کیے گئے مطالعے سے معلوم ہوا ہے کہ گردش کرنے والے ٹرپٹوفن کی کم سطح کا تعلق پھیپھڑوں کے کینسر کے بڑھتے ہوئے خطرے سے ہے 54۔Tryptophan ایک ضروری امینو ایسڈ ہے جو ہمیں مکمل طور پر کھانے سے حاصل ہوتا ہے۔ہم یہ نتیجہ اخذ کرتے ہیں کہ پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما میں سیرم ٹرپٹوفن کی کمی اس میٹابولائٹ کی تیزی سے کمی کی عکاسی کر سکتی ہے۔یہ بات مشہور ہے کہ کائنورینائن پاتھ وے کے ذریعے ٹرپٹوفن کیٹابولزم کی آخری پیداوار ڈی نوو NAD+ ترکیب کا ذریعہ ہے۔چونکہ NAD+ بنیادی طور پر بچاؤ کے راستے سے تیار ہوتا ہے، صحت اور بیماری میں ٹرپٹوفن میٹابولزم میں NAD+ کی اہمیت کا تعین ہونا باقی ہے۔TCGA ڈیٹا بیس کے ہمارے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ عام کنٹرول کے مقابلے پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما میں ٹرپٹوفن ٹرانسپورٹر سالوٹ ٹرانسپورٹر 7A5 (SLC7A5) کے اظہار میں نمایاں اضافہ ہوا تھا اور گلائکولٹک انزائم GAPDH کے اظہار کے ساتھ مثبت طور پر منسلک تھا۔پچھلے مطالعات میں بنیادی طور پر اینٹیٹیمر مدافعتی ردعمل کو دبانے میں ٹرپٹوفن کیٹابولزم کے کردار پر توجہ مرکوز کی گئی ہے40,41,42۔یہاں ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ پھیپھڑوں کے کینسر کے خلیوں میں SLC7A5 کے دستک ڈاؤن کے ذریعہ ٹرپٹوفن اپٹیک کی روک تھام کے نتیجے میں سیلولر NAD کی سطح میں کمی واقع ہوتی ہے اور گلائکولٹک سرگرمی کی ہم آہنگی میں کمی واقع ہوتی ہے۔خلاصہ یہ کہ ہمارا مطالعہ پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کی مہلک تبدیلی سے وابستہ سیرم میٹابولزم میں تبدیلیوں کے لیے حیاتیاتی بنیاد فراہم کرتا ہے۔
این ایس سی ایل سی کے مریضوں میں EGFR اتپریورتن سب سے عام ڈرائیور تغیرات ہیں۔ہمارے مطالعے میں، ہم نے پایا کہ EGFR اتپریورتن (n = 41) کے مریضوں میں مجموعی طور پر میٹابولومک پروفائلز جنگلی قسم کے EGFR (n = 31) والے مریضوں کی طرح ہوتے ہیں، حالانکہ ہمیں acylcarnitine کے مریضوں میں کچھ EGFR اتپریورتی مریضوں کے سیرم کی سطح میں کمی واقع ہوئی ہے۔acylcarnitines کا قائم کردہ کام acyl گروپوں کو cytoplasm سے mitochondrial میٹرکس میں منتقل کرنا ہے، جس سے توانائی پیدا کرنے کے لیے فیٹی ایسڈز کی آکسیکرن ہوتی ہے۔ہمارے نتائج سے ہم آہنگ، ایک حالیہ مطالعہ نے EGFR اتپریورتی اور EGFR جنگلی قسم کے ٹیومر کے درمیان 102 پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما ٹشو نمونوں کے عالمی میٹابولوم کا تجزیہ کرکے اسی طرح کے میٹابولوم پروفائلز کی بھی نشاندہی کی۔دلچسپ بات یہ ہے کہ EGFR اتپریورتی گروپ میں acylcarnitine کا مواد بھی پایا گیا۔لہذا، چاہے acylcarnitine کی سطح میں تبدیلیاں EGFR کی حوصلہ افزائی میٹابولک تبدیلیوں کی عکاسی کرتی ہیں اور بنیادی سالماتی راستے مزید مطالعہ کے قابل ہوسکتے ہیں۔
آخر میں، ہمارا مطالعہ پلمونری نوڈولس کی تفریق تشخیص کے لیے سیرم میٹابولک درجہ بندی قائم کرتا ہے اور ایک ایسے ورک فلو کی تجویز پیش کرتا ہے جو خطرے کی تشخیص کو بہتر بنا سکتا ہے اور CT اسکین اسکریننگ کی بنیاد پر کلینیکل مینجمنٹ کو آسان بنا سکتا ہے۔
اس مطالعہ کو سن یات سین یونیورسٹی کینسر ہسپتال کی اخلاقیات کمیٹی، سن یات سین یونیورسٹی کے پہلے منسلک ہسپتال، اور زینگ زو یونیورسٹی کینسر ہسپتال کی اخلاقیات کمیٹی نے منظور کیا تھا۔دریافت اور داخلی توثیق کرنے والے گروپوں میں، صحت مند افراد سے 174 سیرا اور سومی نوڈولس سے 244 سیرا ایسے افراد سے جمع کیے گئے جو کینسر کنٹرول اور روک تھام کے شعبہ، سن یات سین یونیورسٹی کینسر سینٹر میں سالانہ طبی معائنے کر رہے تھے، اور 166 سومی نوڈولس۔سیرماسٹیج I پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوماس سن یات سین یونیورسٹی کینسر سنٹر سے جمع کیے گئے تھے۔بیرونی توثیق کرنے والے گروہ میں، سومی نوڈولس کے 48 کیسز، سن یات سین یونیورسٹی کے پہلے منسلک اسپتال سے اسٹیج I پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کے 39 کیسز، اور زینگ زو کینسر اسپتال سے اسٹیج I پھیپھڑوں کے ایڈینو کارسینوما کے 24 کیسز تھے۔سن یات سین یونیورسٹی کینسر سینٹر نے بھی اسٹیج I اسکواومس سیل پھیپھڑوں کے کینسر کے 16 کیسز اکٹھے کیے تاکہ قائم شدہ میٹابولک درجہ بندی کی تشخیصی صلاحیت کو جانچا جا سکے (مریض کی خصوصیات ضمنی جدول 5 میں دکھائی گئی ہیں)۔دریافت کرنے والے گروہ اور داخلی توثیق کرنے والے گروہ کے نمونے جنوری 2018 اور مئی 2020 کے درمیان جمع کیے گئے تھے۔ بیرونی توثیق کرنے والے گروہ کے نمونے اگست 2021 اور اکتوبر 2022 کے درمیان جمع کیے گئے تھے۔ صنفی تعصب کو کم کرنے کے لیے، تقریباً یکساں تعداد میں مرد اور خواتین کے کیسز کو تفویض کیا گیا تھا۔ گروہڈسکوری ٹیم اور انٹرنل ریویو ٹیم۔شریک کی جنس کا تعین خود رپورٹ کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔تمام شرکاء سے باخبر رضامندی حاصل کی گئی تھی اور کوئی معاوضہ فراہم نہیں کیا گیا تھا۔سومی نوڈولس والے مضامین وہ تھے جن کا تجزیہ کے وقت 2 سے 5 سال میں مستحکم سی ٹی اسکین سکور تھا، سوائے بیرونی توثیق کے نمونے سے 1 کیس کے، جو پہلے سے آپریشنل طور پر اکٹھا کیا گیا تھا اور ہسٹوپیتھولوجی کے ذریعے تشخیص کیا گیا تھا۔دائمی برونکائٹس کے استثناء کے ساتھ۔پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کے کیسز پھیپھڑوں کے ریسیکشن سے پہلے جمع کیے گئے تھے اور پیتھولوجیکل تشخیص سے تصدیق کی گئی تھی۔روزہ رکھنے والے خون کے نمونے بغیر کسی anticoagulants کے سیرم سیپریشن ٹیوبوں میں جمع کیے گئے تھے۔خون کے نمونوں کو کمرے کے درجہ حرارت پر 1 گھنٹہ تک جما دیا گیا اور پھر سیرم سپرنٹنٹ کو جمع کرنے کے لیے 4 ° C پر 10 منٹ کے لیے 2851 × g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔میٹابولائٹ نکالنے تک سیرم ایلی کوٹس کو -80 ° C پر منجمد کردیا گیا تھا۔سن یات سین یونیورسٹی کینسر سینٹر کے شعبہ کینسر کی روک تھام اور طبی امتحان نے 100 صحت مند عطیہ دہندگان سے سیرم کا ایک پول جمع کیا، جن میں 40 سے 55 سال کی عمر کے مرد اور خواتین کی مساوی تعداد بھی شامل تھی۔ہر عطیہ دہندہ کے نمونے کی مساوی مقدار کو ملایا گیا، نتیجے میں پول کو الگ کردیا گیا اور -80 ° C پر محفوظ کیا گیا۔سیرم مرکب کو کوالٹی کنٹرول اور ڈیٹا کی معیاری کاری کے لیے بطور حوالہ مواد استعمال کیا گیا تھا۔
حوالہ سیرم اور ٹیسٹ کے نمونے پگھلائے گئے اور میٹابولائٹس کو ایک مشترکہ نکالنے کا طریقہ (MTBE/میتھانول/پانی) 56 کا استعمال کرتے ہوئے نکالا گیا۔مختصراً، 50 μl سیرم کو 225 μl آئس کولڈ میتھانول اور 750 μl آئس کولڈ میتھائل ٹیرٹ بٹائل ایتھر (MTBE) کے ساتھ ملایا گیا تھا۔مکسچر کو ہلائیں اور برف پر 1 گھنٹہ تک سینکیں۔اس کے بعد نمونوں کو ملایا گیا اور 188 μl MS-گریڈ کے پانی کے ساتھ مکس کیا گیا جس میں اندرونی معیارات (13C-lactate، 13C3-pyruvate، 13C-methionine، اور 13C6-isoleucine، کیمبرج آاسوٹوپ لیبارٹریز سے خریدے گئے)۔اس کے بعد مرکب کو 15,000 × g پر 10 منٹ کے لیے 4 ° C پر سینٹرفیوج کیا گیا، اور نچلے مرحلے کو مثبت اور منفی طریقوں میں LC-MS تجزیہ کے لیے دو ٹیوبوں (ہر ایک میں 125 μL) میں منتقل کیا گیا۔آخر میں، نمونے کو تیز رفتار ویکیوم کنسنٹریٹر میں خشک کرنے کے لیے بخارات بنا دیا گیا۔
خشک میٹابولائٹس کو 120 μl 80% acetonitrile میں دوبارہ تشکیل دیا گیا، 5 منٹ کے لیے بھنور بنایا گیا، اور 4 ° C پر 10 منٹ کے لیے 15,000 × g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔سپرنٹنٹس کو میٹابولومکس اسٹڈیز کے لیے مائیکرو انسرٹس کے ساتھ امبر شیشے کی شیشیوں میں منتقل کیا گیا۔الٹرا پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی-ہائی ریزولوشن ماس اسپیکٹومیٹری (UPLC-HRMS) پلیٹ فارم پر غیر ہدف شدہ میٹابولومکس تجزیہ۔Dionex Ultimate 3000 UPLC سسٹم اور ACQUITY BEH Amide کالم (2.1 × 100 mm، 1.7 μm، Waters) کا استعمال کرتے ہوئے میٹابولائٹس کو الگ کیا گیا تھا۔مثبت آئن موڈ میں، موبائل فیز 95% (A) اور 50% acetonitrile (B) تھے، ہر ایک میں 10 mmol/L امونیم ایسیٹیٹ اور 0.1% فارمک ایسڈ ہوتا ہے۔منفی موڈ میں، موبائل فیز A اور B میں بالترتیب 95% اور 50% acetonitrile شامل تھے، دونوں مراحل میں 10 mmol/L امونیم ایسیٹیٹ، pH = 9۔ گریڈینٹ پروگرام اس طرح تھا: 0-0.5 منٹ، 2% B؛0.5–12 منٹ، 2–50% B؛12–14 منٹ، 50–98% B؛14-16 منٹ، 98% B؛16–16.1۔منٹ، 98 –2% B؛16.1–20 منٹ، 2% B۔ کالم کو 40 ° C اور نمونہ 10 ° C پر آٹو سیمپلر میں برقرار رکھا گیا۔بہاؤ کی شرح 0.3 ملی لیٹر/منٹ تھی، انجیکشن کا حجم 3 μl تھا۔الیکٹرو اسپرے آئنائزیشن (ESI) سورس کے ساتھ ایک Q-Exactive Orbitrap ماس اسپیکٹومیٹر (Thermo Fisher Scientific) مکمل اسکین موڈ میں چلایا گیا اور ddMS2 مانیٹرنگ موڈ کے ساتھ مل کر ڈیٹا کی بڑی مقدار کو اکٹھا کیا گیا۔ایم ایس کے پیرامیٹرز اس طرح ترتیب دیئے گئے تھے: سپرے وولٹیج +3.8 kV/- 3.2 kV، کیپلیری درجہ حرارت 320°C، شیلڈنگ گیس 40 arb، معاون گیس 10 arb، پروب ہیٹر کا درجہ حرارت 350°C، سکیننگ کی حد 70–1050 m/h، قرارداد70 000۔ ڈیٹا Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific) کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کیا گیا تھا۔
ڈیٹا کے معیار کا اندازہ لگانے کے لیے، پولڈ کوالٹی کنٹرول (QC) کے نمونے ہر نمونے سے سپرنٹنٹ کے 10 μL ایلی کوٹس کو ہٹا کر تیار کیے گئے تھے۔UPLC-MS سسٹم کے استحکام کا اندازہ لگانے کے لیے تجزیاتی ترتیب کے آغاز میں چھ کوالٹی کنٹرول نمونے کے انجیکشن کا تجزیہ کیا گیا۔کوالٹی کنٹرول کے نمونے وقفے وقفے سے بیچ میں متعارف کرائے جاتے ہیں۔اس مطالعہ میں سیرم کے نمونوں کے تمام 11 بیچوں کا تجزیہ LC-MS نے کیا تھا۔100 صحت مند عطیہ دہندگان کے سیرم پول مکسچر کے ایلی کوٹس کو متعلقہ بیچوں میں حوالہ مواد کے طور پر استعمال کیا گیا تاکہ نکالنے کے عمل کی نگرانی کی جا سکے اور بیچ ٹو بیچ اثرات کو ایڈجسٹ کیا جا سکے۔دریافت کوہورٹ، اندرونی توثیق کوہورٹ، اور بیرونی توثیق کوہورٹ کا غیر ہدف شدہ میٹابولومکس تجزیہ سن یات سین یونیورسٹی کے میٹابولومکس سینٹر میں کیا گیا تھا۔گوانگ ڈونگ یونیورسٹی آف ٹیکنالوجی اینالیسس اینڈ ٹیسٹنگ سینٹر کی بیرونی لیبارٹری نے بھی کلاسیفائر ماڈل کی کارکردگی کو جانچنے کے لیے بیرونی گروپ کے 40 نمونوں کا تجزیہ کیا۔
نکالنے اور تشکیل نو کے بعد، سیرم میٹابولائٹس کی مطلق مقدار کو الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی-ٹینڈم ماس اسپیکٹومیٹری (ایجیلنٹ 6495 ٹرپل کواڈروپول) کا استعمال کرتے ہوئے ایک الیکٹرو سپرے آئنائزیشن (ESI) سورس کے ساتھ ایک سے زیادہ ردعمل کی نگرانی (MRM) میں ماپا گیا۔میٹابولائٹس کو الگ کرنے کے لیے ایک ACQUITY BEH Amide کالم (2.1 × 100 mm، 1.7 μm، Waters) استعمال کیا گیا تھا۔موبائل فیز میں 90% (A) اور 5% acetonitrile (B) 10 mmol/L امونیم ایسیٹیٹ اور 0.1% امونیا محلول شامل تھا۔میلان پروگرام حسب ذیل تھا: 0-1.5 منٹ، 0% B؛1.5–6.5 منٹ، 0–15% B؛6.5–8 منٹ، 15% B؛8–8.5 منٹ، 15%–0% B؛8.5–11.5 منٹ، 0%Bکالم کو 40 ° C اور نمونہ 10 ° C پر آٹو سیمپلر میں برقرار رکھا گیا تھا۔بہاؤ کی شرح 0.3 ملی لیٹر/منٹ تھی اور انجیکشن کا حجم 1 μL تھا۔MS پیرامیٹرز اس طرح ترتیب دیئے گئے تھے: کیپلیری وولٹیج ±3.5 kV، نیبولائزر پریشر 35 psi، میان گیس کا بہاؤ 12 L/min، میان گیس کا درجہ حرارت 350°C، خشک کرنے والی گیس کا درجہ حرارت 250°C، اور خشک کرنے والی گیس کا بہاؤ 14l/min۔Tryptophan، pyruvate، lactate، hypoxanthine اور xanthine کی MRM تبدیلیاں 205.0–187.9، 87.0–43.4، 89.0–43.3، 135.0–92.3 اور 151.0–107 تھیں۔بالترتیب 9۔ماس ہنٹر B.07.00 (ایجیلنٹ ٹیکنالوجیز) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا اکٹھا کیا گیا۔سیرم کے نمونوں کے لیے، ٹرپٹوفن، پائروویٹ، لییکٹیٹ، ہائپوکسینتھائن، اور زانتھائن کو معیاری مرکب حل کے انشانکن منحنی خطوط کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کی گئی۔سیل کے نمونوں کے لیے، ٹرپٹوفن مواد کو اندرونی معیار اور سیل پروٹین ماس میں معمول بنایا گیا تھا۔
چوٹی نکالنے (m/z اور برقرار رکھنے کا وقت (RT)) کمپاؤنڈ ڈسکوری 3.1 اور ٹریس فائنڈر 4.0 (تھرمو فشر سائنٹیفک) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔بیچوں کے درمیان ممکنہ اختلافات کو ختم کرنے کے لیے، ٹیسٹ کے نمونے کی ہر خصوصیت کی چوٹی کو ایک ہی بیچ کے حوالہ مواد کی خصوصیت کی چوٹی سے تقسیم کیا گیا تاکہ رشتہ دار کثرت حاصل کی جا سکے۔معیاری کاری سے پہلے اور بعد میں داخلی معیارات کے متعلقہ معیاری انحراف کو ضمنی جدول 6 میں دکھایا گیا ہے۔ دونوں گروہوں کے درمیان فرق کو غلط دریافت کی شرح (FDR<0.05، Wilcoxon پر دستخط شدہ رینک ٹیسٹ) اور فولڈ چینج (>1.2 یا <0.83) سے نمایاں کیا گیا تھا۔نکالی گئی خصوصیات کا خام MS ڈیٹا اور حوالہ سیرم سے درست شدہ MS ڈیٹا بالترتیب ضمنی ڈیٹا 1 اور سپلیمنٹری ڈیٹا 2 میں دکھایا گیا ہے۔چوٹی کی تشریح شناخت کی چار متعین سطحوں کی بنیاد پر کی گئی تھی، بشمول شناخت شدہ میٹابولائٹس، پوٹیٹیو اینوٹیٹڈ کمپاؤنڈز، پوٹیٹیو خصوصیات والے کمپاؤنڈ کلاسز، اور نامعلوم مرکبات 22۔کمپاؤنڈ ڈسکوری 3.1 (mzCloud، HMDB، Chemspider) میں ڈیٹا بیس کی تلاش کی بنیاد پر، MS/MS کے ساتھ حیاتیاتی مرکبات جو کہ تصدیق شدہ معیارات سے مماثلت رکھتے ہیں یا mzCloud (اسکور> 85) میں عین مطابق مماثلت تشریحات یا Chemspider کو آخر کار تفریق میٹابولوم کے درمیان انٹرمیڈیٹس کے طور پر منتخب کیا گیا۔سپلیمنٹری ڈیٹا 3 میں ہر فیچر کے لیے چوٹی کی تشریحات شامل ہیں۔MetaboAnalyst 5.0 نے نمایاں طور پر مختلف میٹابولائٹس کی بنیاد پر KEGG پاتھ وے کی افزودگی کے تجزیہ کا بھی جائزہ لیا۔پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) اور جزوی کم سے کم مربع امتیازی تجزیہ (PLS-DA) کا تجزیہ اسٹیک نارملائزیشن اور آٹو اسکیلنگ کے ساتھ ropls سافٹ ویئر پیکج (v.1.26.4) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔نوڈول مہلک پن کی پیش گوئی کرنے کے لیے بہترین میٹابولائٹ بائیو مارکر ماڈل بائنری لاجسٹک ریگریشن کا استعمال کرتے ہوئے کم از کم مطلق سکڑنے اور سلیکشن آپریٹر (LASSO, R پیکیج v.4.1-3) کے ساتھ تیار کیا گیا تھا۔پتہ لگانے اور توثیق کے سیٹوں میں امتیازی ماڈل کی کارکردگی کی خصوصیت پی آر او سی پیکج (v.1.18.0.) کے مطابق ROC تجزیہ کی بنیاد پر AUC کا تخمینہ لگا کر تھی۔زیادہ سے زیادہ امکانی کٹ آف ماڈل کے زیادہ سے زیادہ یوڈن انڈیکس (حساسیت + خصوصیت - 1) کی بنیاد پر حاصل کیا گیا تھا۔حد سے کم یا زیادہ اقدار والے نمونوں کی پیش گوئی بالترتیب سومی نوڈولس اور پھیپھڑوں کے اڈینو کارسینوما کے طور پر کی جائے گی۔
A549 خلیات (#CCL-185، امریکن ٹائپ کلچر کلیکشن) F-12K میڈیم میں اگائے گئے تھے جن میں 10% FBS تھا۔لینٹی وائرل ویکٹر pLKO.1-puro میں SLC7A5 اور نان ٹارگٹنگ کنٹرول (NC) کو نشانہ بنانے والے مختصر ہیئرپین RNA (shRNA) کے سلسلے داخل کیے گئے تھے۔shSLC7A5 کے اینٹی سینس سلسلے درج ذیل ہیں: Sh1 (5′-GGAGAAAACCTGATGAACAGTT-3′)، Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′)۔SLC7A5 (#5347) اور tubulin (#2148) کے اینٹی باڈیز سیل سگنلنگ ٹیکنالوجی سے خریدے گئے تھے۔ایس ایل سی 7 اے 5 اور ٹیوبلین کے اینٹی باڈیز کا استعمال مغربی دھبے کے تجزیہ کے لیے 1:1000 کی کمی پر کیا گیا تھا۔
Seahorse XF Glycolytic Stress Test ایکسٹرا سیلولر تیزابیت (ECAR) کی سطحوں کی پیمائش کرتا ہے۔پرکھ میں، گلوکوز، oligomycin A، اور 2-DG کو ترتیب وار سیلولر گلائکولٹک صلاحیت کی جانچ کرنے کے لیے دیا گیا جیسا کہ ECAR کے ذریعے ماپا گیا ہے۔
نان ٹارگٹنگ کنٹرول (NC) اور shSLC7A5 (Sh1, Sh2) کے ساتھ تبدیل شدہ A549 خلیات کو 10 سینٹی میٹر قطر کے برتنوں میں راتوں رات چڑھایا گیا تھا۔سیل میٹابولائٹس کو 1 ملی لیٹر آئس کولڈ 80٪ آبی میتھانول کے ساتھ نکالا گیا تھا۔میتھانول کے محلول میں موجود خلیات کو کھرچ کر ایک نئی ٹیوب میں جمع کیا گیا، اور 4°C پر 15 منٹ کے لیے 15,000 × g پر سینٹرفیوج کیا گیا۔800 µl سپرنٹنٹ جمع کریں اور تیز رفتار ویکیوم کنسنٹریٹر کا استعمال کرتے ہوئے خشک کریں۔اس کے بعد خشک میٹابولائٹ چھروں کا تجزیہ LC-MS/MS کا استعمال کرتے ہوئے ٹرپٹوفن لیول کے لیے کیا گیا جیسا کہ اوپر بیان کیا گیا ہے۔A549 خلیات (NC اور shSLC7A5) میں سیلولر NAD(H) کی سطحوں کو مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق ایک مقداری NAD+/NADH رنگین میٹرک کٹ (#K337، BioVision) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔میٹابولائٹس کی مقدار کو معمول پر لانے کے لیے ہر نمونے کے لیے پروٹین کی سطح کی پیمائش کی گئی۔
ابتدائی طور پر نمونے کے سائز کا تعین کرنے کے لیے کوئی شماریاتی طریقہ استعمال نہیں کیا گیا۔پچھلی میٹابولومکس اسٹڈیز جن کا مقصد بائیو مارکر کی دریافت 15,18 کو سائز کے تعین کے لیے معیار کے طور پر سمجھا جاتا ہے، اور ان رپورٹس کے مقابلے میں، ہمارا نمونہ کافی تھا۔مطالعہ کے گروپ سے کوئی نمونہ خارج نہیں کیا گیا تھا۔سیرم کے نمونے تصادفی طور پر ایک دریافت گروپ (306 کیسز، 74.6%) اور اندرونی توثیق گروپ (104 کیسز، 25.4%) کو غیر ہدف شدہ میٹابولومکس اسٹڈیز کے لیے تفویض کیے گئے تھے۔ہم نے تصادفی طور پر ہر گروپ سے 70 کیسز کو ٹارگٹڈ میٹابولومکس اسٹڈیز کی دریافت سے منتخب کیا۔LC-MS ڈیٹا اکٹھا کرنے اور تجزیہ کرنے کے دوران تفتیش کاروں کو گروپ تفویض سے اندھا کر دیا گیا تھا۔میٹابولومکس ڈیٹا اور سیل کے تجربات کے شماریاتی تجزیے متعلقہ نتائج، فگر لیجنڈز اور میتھڈز سیکشنز میں بیان کیے گئے ہیں۔سیلولر ٹرپٹوفن، این اے ڈی ٹی، اور گلائکولٹک سرگرمی کی مقدار کو ایک جیسے نتائج کے ساتھ آزادانہ طور پر تین بار انجام دیا گیا۔
مطالعہ کے ڈیزائن کے بارے میں مزید معلومات کے لیے، اس مضمون سے وابستہ نیچرل پورٹ فولیو رپورٹ کا خلاصہ دیکھیں۔
نکالے گئے فیچرز کا خام ایم ایس ڈیٹا اور ریفرنس سیرم کا نارملائزڈ ایم ایس ڈیٹا بالترتیب سپلیمنٹری ڈیٹا 1 اور سپلیمنٹری ڈیٹا 2 میں دکھایا گیا ہے۔امتیازی خصوصیات کے لیے چوٹی کی تشریحات ضمنی ڈیٹا 3 میں پیش کی گئی ہیں۔ LUAD TCGA ڈیٹاسیٹ کو https://portal.gdc.cancer.gov/ سے ڈاؤن لوڈ کیا جا سکتا ہے۔گراف کو پلاٹ کرنے کے لیے ان پٹ ڈیٹا سورس ڈیٹا میں فراہم کیا گیا ہے۔اس مضمون کے لیے ماخذ کا ڈیٹا فراہم کیا گیا ہے۔
قومی پھیپھڑوں کی اسکریننگ اسٹڈی گروپ وغیرہ۔ کم خوراک کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی کے ساتھ پھیپھڑوں کے کینسر سے ہونے والی اموات کو کم کرنا۔شمالی انگلینڈ۔جے میڈ365، 395–409 (2011)۔
کریمر، بی ایس، برگ، کے ڈی، ایبرل، ڈی آر اور نبی، پی سی پھیپھڑوں کے کینسر کی اسکریننگ کم خوراک والی ہیلیکل سی ٹی کا استعمال کرتے ہوئے: قومی پھیپھڑوں کی اسکریننگ اسٹڈی (NLST) کے نتائج۔جے میڈاسکرین 18، 109–111 (2011)۔
ڈی کوننگ، ایچ جے، وغیرہ۔بے ترتیب آزمائش میں والیومیٹرک سی ٹی اسکریننگ کے ساتھ پھیپھڑوں کے کینسر کی اموات کو کم کرنا۔شمالی انگلینڈ۔جے میڈ382، 503–513 (2020)۔