CRISPR) ایک تیسری نسل کی جینوم ایڈیٹنگ تکنیک ہے: CRISPR نے دنیا میں انقلاب برپا کر دیا۔

کلسٹرڈ ریگولرلی انٹر اسپیسڈ شارٹ پیلینڈرومک ریپیٹس (CRISPR) ایک تیسری نسل کی جینوم ایڈیٹنگ تکنیک ہے جس نے اپنے اعلی تھرو پٹ نتائج کے ساتھ دنیا میں انقلاب برپا کر دیا ہے۔ یہ مختلف حیاتیاتی بیماریوں اور انفیکشن کے علاج کے لیے استعمال ہوتا رہا ہے۔ مختلف بیکٹیریا اور دیگر پروکیریٹس (جیسے آثار قدیمہ) کے پاس بھی CRISPR/Cas9 نظام ہوتے ہیں جو فیز کے خلاف دفاع کرتے ہیں۔ یہ اطلاع دی گئی ہے کہ CRISPR/Cas9 پر مبنی حکمت عملی ٹرپل منفی چھاتی کے کینسر (TNBC) کی نشوونما اور بڑھنے کو ممکنہ طور پر تبدیل شدہ مزاحمتی جینز، ٹرانسکرپشن، اور ایپی جینیٹک ریگولیشن کو نشانہ بنا کر روک سکتی ہے۔ یہ علاج کی مداخلتیں چیلنجنگ مسائل جیسے کہ TNBC میں بھی منشیات کی مزاحمت کا مشاہدہ کرنے میں مدد کر سکتی ہیں۔ فی الحال، CRISPR/Cas9 کو خلیات کو ہدف بنانے کے لیے مختلف طریقے استعمال کیے جاتے ہیں، جیسے کہ فزیکل (مائکرو انجیکشن، الیکٹروپوریشن اور ہائیڈروڈینامک موڈز)، وائرل (اڈینو سے وابستہ وائرس اور لینٹیو وائرس) اور غیر وائرل (لپوسومز اور لپڈ نینو پارٹیکلز)۔ ذرات)۔ اگرچہ TNBC کی مالیکیولر وجوہات کا مطالعہ کرنے کے لیے مختلف ماڈلز تیار کیے گئے ہیں، لیکن Vivo میں جینوم ایڈیٹنگ ٹولز کی فراہمی کے لیے حساس اور ٹارگٹڈ طریقوں کی کمی ان کے طبی استعمال کو محدود کرتی ہے۔ خلاصہ یہ کہ یہ جائزہ موجودہ شواہد کی بنیاد پر TNBC کے لیے CRISPR/Cas9 علاج کی پیشرفت، چیلنجز، حدود اور امکانات کا جامع جائزہ لیتا ہے۔ ہم اس بات پر بھی روشنی ڈالتے ہیں کہ کس طرح مصنوعی ذہانت اور مشین لرننگ کا امتزاج TNBC کے علاج میں CRISPR/Cas9 حکمت عملیوں کو بہتر بنا سکتا ہے۔
کینسر کی خصوصیت سیل کی بے قابو تقسیم، سیل سائیکل چیک پوائنٹس میں خلل، اور ٹیومر دبانے والے جینز (TSGs) میں تغیرات (Matthews et al.، 2022) سے ہوتی ہے۔ کینسر کی مختلف اقسام میں، چھاتی کا کینسر خواتین میں کینسر کی سب سے عام قسم ہے اور دنیا بھر میں اس کی شرح اموات بہت زیادہ ہے (ویکس اینڈ وائنر، 2019)۔ چھاتی کا کینسر متنوع خصوصیات کے ساتھ ایک متفاوت بیماری ہے، جیسے ہسٹولوجیکل اور حیاتیاتی خصوصیات، طبی پیشکش اور رویے، اور علاج کے لیے ردعمل (ویگلٹ ایٹ ال۔، 2010)۔ چھاتی کے کینسر کی درجہ بندی چھاتی کے کینسر کی تشخیص اور ٹیومر کی تشخیص کے لیے قطعی بصیرت فراہم کرتی ہے۔ عام بائیو مارکرز اور کلینکوپیتھولوجیکل خصوصیات کا استعمال چھاتی کے کینسر کی درجہ بندی کا بنیادی معیار رہا ہے (Tsang and Tse، 2019)۔ چھاتی کے کینسر کے علاج کا تشخیص اور ردعمل متعدد عوامل سے متاثر ہوتا ہے، بشمول ایسٹروجن ریسیپٹر (ER)، پروجیسٹرون ریسیپٹر (PR)، انسانی ایپیڈرمل گروتھ فیکٹر ریسیپٹر 2 (HER2/neu)، اور ہسٹولوجیکل گریڈ، ٹیومر کی قسم، اور گریڈ۔ سائز اور لمف نوڈ میٹاسٹیسیس (الطبیعت، 2020)۔ چھاتی کے کینسر کی پانچ اندرونی مالیکیولر ذیلی قسموں کی نشاندہی کی گئی ہے، جن میں luminal A، luminal B، HER2-enriched، basal-like، اور claudin-low (Prat et al.، 2015) شامل ہیں۔ TNBC کینسر کی ایک سالماتی ذیلی قسم ہے جو تمام ER، PR، اور HER2 (Yin et al., 2020) کا اظہار نہیں کرتی ہے۔ یہ پیتھولوجیکل خصوصیات TNBC کے ساتھ وابستہ ہیں، جو اس کی تیز رفتار ترقی اور چھاتی کے کینسر کی کسی بھی دوسری قسم کے مقابلے میں زیادہ جارحانہ نوعیت کی تصدیق کرتی ہیں (Feng et al.، 2018)۔ مزید برآں، پیرو ایٹ ال (2000) نے چھاتی کے کینسر کی دوبارہ درجہ بندی کرنے اور چھاتی کے کینسر کی پانچ اندرونی ذیلی قسموں کی شناخت کے لیے مائیکرو رے ٹیکنالوجی کا استعمال کیا (کیڈینس، 2012)۔ بیسل جیسا چھاتی کا کینسر چھاتی کے کینسر کی ایک ذیلی قسم ہے جس میں تین گنا منفی فینوٹائپ ہوتا ہے اور اس کا تعلق تیزی سے بڑھنے سے ہوتا ہے۔ واضح رہے کہ تمام بیسل جیسے چھاتی کے کینسر کی عام طور پر TNBC کے نام سے غلط تشخیص کی جاتی ہے، لیکن صرف 77% TNBC ہیں۔ اس کے برعکس، TNBC کا 71–91% بیسال جیسا ہے، جو اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ چھاتی کے کینسر کی یہ دو اقسام اوورلیپ ہوتی ہیں اور مختلف درجہ بندیوں کی نمائندگی کرتی ہیں (Wang D.-Y. et al., 2019)۔ اس سے تشخیص کو واضح کرنے اور موجودہ اور مستقبل کے علاج کے ممکنہ ردعمل کی نشاندہی کرنے کے لیے TNBC کی متفاوتیت کو نمایاں کرنے کی ضرورت پیدا ہوتی ہے۔ مزید برآں، TNBC چھاتی کے کینسر کے تمام کیسز میں سے 15-20% ہے اور یہ 50 سال سے کم عمر کی خواتین میں زیادہ عام ہے۔ BRCA1 یا BRCA2 تغیرات TNBC کے تقریباً 20% کیسز میں رپورٹ ہوئے ہیں (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017)۔ ، 2020)۔ مطالعات نے یہ بھی دکھایا ہے کہ TNBC میں ایک الگ مدافعتی مائکرو ماحولیات ہے جس میں ویسکولر اینڈوتھیلیل گروتھ فیکٹرز، ٹیومر سے وابستہ میکروفیجز (TAMs)، ٹیومر سے گھسنے والے لیمفوسائٹس (TILs)، اور ٹیومر کی نشوونما اور منتقلی میں شامل دیگر مالیکیولز شامل ہیں۔ لہذا، TNBC کے مائیکرو ماحولیات کو سمجھنا اس کی تشخیص اور علاج کے لیے اہم ہے (فین اینڈ ہی، 2022)۔
TNBC کی تشخیص کا اندازہ لگانے اور مؤثر علاج کو یقینی بنانے کے لیے، درست تشخیص، بنیادی طور پر ER، PR اور HER2 کا پتہ لگانے کے لیے امیونو ہسٹو کیمسٹری (IHC) پر مبنی، اور چھاتی کے نوپلاسمز کا پتہ لگانے کے لیے میموگرافی، اہم ہے۔ تاہم، میموگرافی انٹراٹومورل خصوصیات جیسے نیکروسس اور فائبروسس کو مناسب طور پر نہیں دکھا سکتی (دیپک سنگھ ایٹ ال۔، 2021)۔ چونکہ خراب تشخیص اور تشخیص ڈاکٹروں کو صحیح دوائیں تجویز کرنے سے روکتی ہے (چوہدری، 2020)، TNBC کے مریضوں کی دیکھ بھال کو بہتر بنانے کے لیے مختلف حکمت عملیوں کا استعمال کیا جاتا ہے۔ فی الحال، دو ادویات، doxorubicin اور cyclophosphamide، TNBC کے مریضوں میں استعمال کی جاتی ہیں اور ان کے اچھے نتائج سامنے آئے ہیں۔ اس کے علاوہ، دیگر پلاٹینم ادویات استعمال کی جاتی ہیں، جیسے کاربوپلاٹن اور سسپلٹین (Sikov et al.، 2015)۔ اس کے علاوہ، PARP inhibitors جیسے Olaparib، Velaparib، اور PF-01367338 TNBC کے علاج کے لیے ممکنہ کیموتھریپی ادویات کے طور پر استعمال کیے گئے ہیں (Ishino et al., 2018)۔ چونکہ Wnt/b-Catenin، NOTCH، اور Hedgehog سگنلنگ راستے TNBC کے ہونے اور بڑھنے میں ملوث ہونے کی اطلاع دی گئی ہے، اس لیے ان راستوں پر منشیات کو نشانہ بنانا ایک اہم حکمت عملی ہو سکتی ہے (Aysola et al.، 2013)۔ اگرچہ سرجری، تابکاری تھراپی اور کیموتھراپی آج TNBC کے علاج کا بنیادی مرکز بنے ہوئے ہیں، نئے علاج جن میں ٹارگٹڈ تھراپی، امیونو تھراپی، مختلف CRISPR سے متعلقہ جین ایڈیٹنگ ٹولز جیسے Cas9n، dCas9 کی تیاری میں اہم پیش رفت ہوئی ہے۔ CRISPR/Cas12، پرائم ایڈیٹنگ، اور CRISPR/Cas9 ٹارگٹڈ جین تھراپی۔ یہاں ہم TNBC کے علاج میں استعمال ہونے والے مختلف CRISPR سے متعلقہ جین ایڈیٹنگ ٹولز پر توجہ مرکوز کریں گے۔ ان میں سے، CRISPR/Cas9 نے بڑے پیمانے پر توجہ حاصل کی ہے۔
Cas9n، جسے Cas9 nickase کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، CRISPR/Cas9 جینوم ایڈیٹنگ سسٹم (Gupta et al.، 2019) سے اخذ کردہ Cas9 پروٹین کا جینیاتی طور پر انجنیئر کردہ مختلف قسم ہے۔ اپنی اصل شکل میں، Cas9 پروٹین دو نیوکلیز ڈومینز پر مشتمل ہے: RuvC اور HNH، جس کا بنیادی کام دونوں DNA اسٹرینڈز کا کلیویج ہے۔ تاہم، Cas9n میں، نیوکلیز ڈومینز میں سے ایک، HNH، جینیاتی طور پر تبدیل ہوتا ہے اور غیر فعال ہوجاتا ہے۔ لہذا، Cas9n کا HNH ڈومین غیر فعال رہتا ہے۔ صرف RuvC ڈومین فعال رہتا ہے، جس سے Cas9n کو واحد DNA اسٹرینڈز (Trevino and Zhang، 2014) پر وقفے کاٹنے یا تخلیق کرنے کی اجازت ملتی ہے۔ Cas9 کے مقابلے میں، Cas9n مؤثر طریقے سے آف ٹارگٹ اثرات کو کم کر سکتا ہے اور سیل کی مرمت کے طریقہ کار کو درست طریقے سے بہتر بنا سکتا ہے۔ Cas9n کو مختلف مسائل کو حل کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، جیسے کہ ڈبل پھنسے ہوئے DNA میں مخصوص مقامات پر وقفے پیدا کرنا۔ اس مقصد کے لیے دو Cas9n مالیکیولز کو ملا کر استعمال کیا گیا (Yee, 2016)۔ مخلوط نسب کناز 3 (MLK3) ایک mitogen-activated protein kinase ہے جو TNBC میٹاسٹیسیس (Cronan et al.، 2012) کے دوران کلیدی ریگولیٹر کے طور پر کام کرتا ہے۔
MLK3 TNBC میٹاسٹیسیس کی طرف جانے والے متعدد سگنلنگ راستوں کو چالو کر سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، c-Jun N-terminal kinase (JNK) راستہ سیل کی حرکت پذیری اور ایکسٹرا سیلولر میٹرکس کے انحطاط کو منظم کرتا ہے، اور MLK3 JNK کے راستے کو متحرک کرتا ہے، اس طرح سیل کی حرکت پذیری کو بڑھاتا ہے اور ناگوار خصوصیات عطا کرتا ہے (Rattanasinchai and Gallo، 2016)۔ MLK3 EMT کو بھی منظم کرتا ہے۔ ایسا کرنے کے لیے، یہ ڈاؤن اسٹریم ٹرانسکرپشن فیکٹرز جیسے کہ سنایل، سلگ اور ٹوئسٹ کو متحرک کرتا ہے۔ یہ عوامل اپکلا مارکروں کے اظہار کو روکتے ہیں اور mesenchymal مارکر کے اظہار کو فروغ دیتے ہیں، جس کے نتیجے میں میٹاسٹیٹک فینوٹائپ (Casalino et al.، 2023) کا حصول ہوتا ہے۔ MLK3 کو ECM کو دوبارہ بنانے اور پروٹیز جیسے میٹرکس میٹالوپروٹیناسز (MMPs) کو چالو کرنے میں ایک کردار ادا کرتے ہوئے دیکھا گیا ہے جو ECM کو کم کرتے ہیں۔ یہ ٹیومر سیل کے حملے اور دور دراز مقامات پر پھیلنے میں سہولت فراہم کرتا ہے (Katari et al.، 2019)۔ اس طرح، پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ MLK3 TNBC میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے۔ رتناسینچائی اور گیلو نے MLK3 کے کردار کا مطالعہ کرنے کے لیے TNBC ماڈلز کا استعمال کیا اور پایا کہ یہ مخصوص سگنلنگ راستوں کے ذریعے کینسر کی نشوونما کو فروغ دیتا ہے۔ انہوں نے MLK3 میں ترمیم کرنے کے لیے CRISPR/Cas9n کا استعمال کیا اور TNBC میٹاسٹیسیس (Rattanasinchai and Gallo، 2016) میں نمایاں کمی دیکھی۔
dCas9، جسے اکثر غیر فعال Cas9 کہا جاتا ہے، Cas9 پروٹین کی ایک ترمیم شدہ مشتق شکل ہے۔ فعال Cas9 کے برعکس، dCas9 میں endonuclease سرگرمی کا فقدان ہے، جس کی وجہ سے یہ DNA ڈبل اسٹرینڈ وقفے کو دلانے سے قاصر ہے۔ لہذا، dCas9 کو ڈی این اے کی ترتیب میں کسی تبدیلی یا ترمیم کے بغیر جینوم کے مخصوص علاقوں کو ٹھیک ٹھیک نشانہ بنانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے (Wang et al., 2016)۔ dCas9 میں، دو endonuclease پروٹین، RuvC اور HNH، اہم امینو ایسڈ کی باقیات کو دبا کر غیر فعال ہو جاتے ہیں۔ (Richter et al.، 2016)۔ ڈی این اے کلیویج سرگرمی کی کمی کے باوجود، dCas9 جینیاتی تحقیق اور بائیو ٹیکنالوجی میں کئی اہم کردار ادا کرتا ہے۔ مثال کے طور پر، یہ جینوم کے مخصوص خطوں کو دیکھنے کی اجازت دیتا ہے، ٹرانسکرپشن ریگولیشن کی سہولت فراہم کرتا ہے، اور ایپی جینیٹک ترمیم کو فروغ دیتا ہے (Brocken et al.، 2018)۔
ٹرانسکرپشن فیکٹر ZEB1 (زنک فنگر ای باکس بائنڈنگ ہومیوباکس 1) اپیٹیلیل-میسینچیمل ٹرانزیشن (EMT) کی ثالثی میں ایک مخصوص اور اہم کردار ادا کرتا ہے، ایک سیلولر عمل جو برانن کی نشوونما، ٹشو کی مرمت اور کینسر کے بڑھنے کے دوران ہوتا ہے۔ اس میں اپکلا خلیوں کی mesenchymal خلیوں میں تبدیلی شامل ہے، جس کے نتیجے میں سیل کی شکل، حرکت پذیری، حملہ آوری، وغیرہ میں تبدیلیاں آتی ہیں (Wu et al., 2020)۔ ZEB1 ایک سے زیادہ اپیٹیلیل مارکروں کو روکتا ہے، جیسے E-cadherin اور Occludin، جو TNBC (مورینو-بیوینو ایٹ ال۔، 2008) میں سیل سیل چپکنے اور اپکلا خلیوں کی قطبیت کو برقرار رکھنے کے ذمہ دار ہیں۔ اس کے علاوہ، ZEB1 بعض مارکروں کو فعال کرتا ہے جیسے کہ N-cadherin، vimentin اور fibronectin (Konradi et al., 2014) اور cytoskeletal remodeling جیسے Rho GTPases اور matrix metalloproteinases (MMPs) (Huang) کو بھی منظم کرتا ہے۔ et al.، 2014)۔ 2022)، اس کے علاوہ، یہ سگنلنگ کے مختلف راستوں کو بھی متاثر کرتا ہے جیسے ٹرانسفارمنگ گروتھ فیکٹر-β (TGF-β)، Wnt سگنلنگ، وغیرہ، اس طرح TNBC میں ٹیومر کے حملے اور میٹاسٹیسیس کو فروغ دیتا ہے (Chen et al. , 2016)۔ )۔ متعدد مطالعات اور سائنسی شواہد اس بات کی نشاندہی کرتے ہیں کہ ZEB1 میں TNBC کا پتہ لگانے اور علاج معالجے کے لیے ایک قابل قدر ایجنٹ کے طور پر بڑی صلاحیت ہے۔ ایک حالیہ مطالعہ میں، Waryah et al. ایک TNBC ماڈل استعمال کیا اور dCas9 کے ذریعہ ZEB1 کا مکمل دباو حاصل کیا۔ اس طرح، انہوں نے Vivo حالات میں ZEB1 کی بہت زیادہ خصوصیت اور تقریباً مکمل روک تھام کا مشاہدہ کیا (وریاہ ایٹ ال۔، 2023)۔
CRISPR/Cas12 ایک جین ایڈیٹنگ ٹول ہے جسے CRISPR/Cpf1 کہا جاتا ہے۔ یہ CRISPR/Cas سسٹم سے ماخوذ ہے، جہاں Cas12 کی اصطلاح سے مراد CRISPR سے وابستہ پروٹین 12 (Bharathkumar et al., 2022) ہے، جو مکمل طور پر Cas9 سے ملتا جلتا ہے۔ فرق صرف اتنا ہے کہ اس میں Cas12 پروٹین ہوتا ہے۔ Cas9 کے مقابلے میں، Cas12 میں کچھ منفرد فنکشنز ہیں جیسے جین ایڈیٹنگ کے عمل کے دوران چپچپا سرے پیدا کرنا، جب کہ Cas9 کند سرے پیدا کرتا ہے (Wang et al., 2021)۔ Cas12 کی یہ خاصیت اس کی مخصوص DNA ہیرا پھیری کی ٹیکنالوجی میں حصہ ڈالتی ہے۔ ایک پروٹین کے طور پر جو ہدف ڈی این اے کو درست طریقے سے پہچاننے اور کاٹنے کی صلاحیت رکھتا ہے، اس میں غیر معمولی استعداد ہے، جو اسے جین ایڈیٹنگ سمیت متعدد ایپلی کیشنز کے لیے ایک موثر ٹول بناتی ہے (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019)۔
CRISPR کی دیگر اقسام کی طرح، CRISPR/Cas12 بھی TNBC میں جینز کو ناک آؤٹ یا فعال کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے، ان جینوں کو نشانہ بناتا ہے جو اس کے روگجنن یا علاج کے ردعمل میں اہم کردار ادا کرتے ہیں (یانگ اور ژانگ، 2023)۔ اس عمل کو پورا کرنے کے لیے، ایک گائیڈ RNA (gRNA) تیار کیا گیا جو Cas12 کو ہدف کے جین کی طرف لے جاتا ہے۔ ایک بار جب Cas12 اپنے ہدف سے جڑ جاتا ہے، تو یہ DNA میں ڈبل اسٹرینڈ بریکس متعارف کراتا ہے اور DNA کی مرمت کے طریقہ کار کو چالو کرتا ہے۔ مرمت کے عمل کے دوران، غلط نیوکلیوٹائڈز کو شامل کیا جا سکتا ہے، جس کی وجہ سے جین کی تبدیلی اور فنکشن ختم ہو جاتا ہے (Zhang et al., 2021a)۔ اس کے علاوہ، Cas12 انزائم کا ایک بہتر ورژن (جسے dCas12 کہا جاتا ہے) بھی جینز کو فعال کرنے کے لیے استعمال کیا گیا۔ اسے ٹرانسکرپشن ایکٹیویٹر کے ساتھ جوڑ کر، بعض جینز کو متحرک کرنا ممکن ہے، اس طرح ان کو متحرک کیا جا سکتا ہے۔ اس ٹیکنالوجی میں ٹیومر کو دبانے والے جینز کی ایکٹیویشن کو فروغ دینے کی بڑی صلاحیت ہے (Sultan et al., 2022)۔
پرائم ایڈیٹنگ ایک نئی ترقی یافتہ اور انتہائی اعلیٰ جینوم ایڈیٹنگ ٹیکنالوجی ہے۔ یہ کسی جاندار کے ڈی این اے کو بہت درست طریقے سے تبدیل کرنے کی صلاحیت رکھتا ہے (چن اور لیو، 2023)۔ پرائم ایڈیٹنگ دو اہم اجزاء کے انضمام کے ذریعے حاصل کی جاتی ہے: ایک ترمیم شدہ CRISPR/Cas9 انزائم اور ریورس ٹرانسکرپٹیس۔ CRISPR/Cas9 انزائم کا کردار جینوم میں صحیح جگہوں کو منتخب طور پر نشانہ بنانا ہے، جبکہ ریورس ٹرانسکرپٹیس ہدف کے مقام پر ڈی این اے کو مکمل طور پر تبدیل کرنے میں مدد کرتا ہے (حسن ایٹ ال۔، 2021)۔ پرائمر ایڈیٹنگ میکانزم میں، پہلے مرحلے میں پرائمر ایڈیٹنگ گائیڈ RNA (pegRNA) (Standage-Beier et al., 2021) کی تخلیق شامل ہے۔ یہ ہدف کی ترتیب اور آر این اے ٹیمپلیٹ پر مشتمل ہے جو ٹارگٹ ڈی این اے میں مطلوبہ ایڈیٹنگ سائٹ کے مطابق ہے۔ پھر pegRNA کو پرائمر ایڈیٹنگ نیوکلیز (PE2) کے ساتھ ٹارگٹ سیلز میں متعارف کرایا جاتا ہے۔ PE2 ایک فیوژن پروٹین ہے جس میں Cas9 انزائم، ایک ریورس ٹرانسکرپٹیس، اور ایک پرائمر ایڈیٹنگ اڈاپٹر ہوتا ہے (Martín-Alonso et al.، 2021)۔ سیل کے اندر، pegRNA اور PE2 کمپلیکس اس مخصوص DNA کی تلاش کرتے ہیں جس میں وہ ترمیم کرنا چاہتے ہیں۔ Cas9 اینزائم ڈی این اے کو کاٹتا ہے اور سنگل اسٹرینڈز پر مشتمل ایک ٹیمپلیٹ بناتا ہے (چوئی ایٹ ال۔، 2022)۔ ریورس ٹرانسکرپٹیس اس ٹیمپلیٹ کو ڈی این اے کو ترمیم کے لیے تیار کرنے کے لیے استعمال کرتا ہے۔ ڈی این اے کاپی کرنے کے ساتھ ساتھ آر این اے ٹیمپلیٹ میں ترمیم کرنے کی ہدایات بھی شامل ہیں۔ آخر میں، نئے بنائے گئے ڈی این اے اسٹرینڈ کو ڈی این اے میں ٹوٹ پھوٹ کو ٹھیک کرنے کے لیے ایک ٹیمپلیٹ کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، جس کے نتیجے میں مطلوبہ ترمیم پر مشتمل ڈی این اے کی ترتیب تبدیل ہوتی ہے (اوچوآ-سانچیز ایٹ ال۔، 2021)۔ پرائمر ایڈیٹنگ میکانزم جینز میں بڑے پیمانے پر تغیرات کا باعث بن سکتے ہیں۔ یہ پوائنٹ کی تبدیلیوں، اندراجات، حذف کرنے، اور یہاں تک کہ جین کی تبدیلی کو بھی نشانہ بنا سکتا ہے (انزالون ایٹ ال۔، 2019؛ چن اور لیو، 2023)۔ پرائم ایڈیٹنگ پچھلی جینوم ایڈیٹنگ ٹیکنالوجیز کے مقابلے میں کئی فوائد پیش کرتی ہے۔ ان میں درستگی میں اضافہ، ہدف سے باہر کے اثرات میں کمی، اور DNA ڈبل اسٹرینڈ بریکس پر انحصار کیے بغیر ڈی این اے میں ترمیم کرنے کی صلاحیت شامل ہے ( Anzalone et al., 2020)۔
CRISPR/Cas9 ٹیکنالوجی اصل میں بیکٹیریا کو پلازمیڈ ٹرانسفر اور فیز انفیکشن سے بچانے کے لیے تیار کی گئی تھی اور بعد میں اسے جینوم ایڈیٹنگ کے لیے RNA پر مبنی DNA ٹارگٹنگ ٹول کے طور پر دوبارہ تیار کیا گیا تھا (جیانگ اور ڈوڈنا، 2017)۔ اس کے علاوہ، CRISPR/Cas9 سسٹم کے بالترتیب 50% اور 87% بیکٹیریل اور آرکیئل جینوم میں موجود ہونے کی اطلاع دی گئی ہے (Ishino et al., 2018)۔ CRISPR/Cas9 Vivo اور in Vitro موڈز ( Sabit et al. مزید برآں، CRISPR/Cas9 کو اپنی دلچسپی کے ہدف والے جینز کے لیے مخصوص ہونے کی وجہ سے مدافعتی نظام کا حصہ دکھایا گیا ہے (چن اور ژانگ، 2018)۔
CRISPR/Cas9 Cas9 اور سنگل گائیڈ RNA (sgRNA) پر مشتمل ہے۔ Cas9 ایک اینڈونکلیز ہے جو متعدد پروٹین اجزاء پر مشتمل ہے۔ اس کے علاوہ، Cas9 میں منفرد ساختی اور تعمیری خصوصیات ہیں (Pacesa et al., 2022) کیونکہ یہ دو لابس پر مشتمل ہے: ریکگنیشن (REC) اور نیوکلیز (NUC)۔ REC لوب کو مزید تین خطوں میں تقسیم کیا گیا ہے: REC1، REC2، اور برج ہیلیکس (Cromwell et al.، 2018)۔ NUC تین لابس پر مشتمل ہے، یعنی RuvC (RuvC I، RuvC II، RuvC III)، HNH اور پروٹو اسپیسر ملحقہ شکل (PAM) انٹرایکشن ڈومین (تصویر 1) (Song et al.، 2016)۔ sgRNA دو اجزاء پر مشتمل ہے، بشمول CRISPR RNA (crRNA) اور چھوٹے RNA (ٹریسر RNA) (شکل 1) کو ٹرانس کوڈنگ کرنا۔ sgRNA ایک فعال کمپلیکس بنانے کے لیے Cas9 پروٹین کو connexins سے جوڑتا ہے، جسے انفیکٹر کمپلیکس بھی کہا جاتا ہے (Richter et al.، 2012)۔ crRNA ایک 18-20 نیوکلیوٹائڈ بیس جوڑا ہے جو ہدف DNA کی ترتیب کو پہچاننے میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، ہدف ڈی این اے کے ساتھ crRNA جوڑے، اور tracrRNA ہدف کے ڈی این اے کو باندھنے کے لیے Cas9 نیوکلیز کے لیے ایک سہار کے طور پر کام کرتا ہے (Manghwar et al., 2019)۔ دوسری طرف، پی اے ایم کی ترتیب میں 3 نیوکلیوٹائڈز ہیں، جو ڈی این اے سے انفیکٹر کمپلیکس کے پابند ہونے کی تصدیق، وضاحت اور ثالثی کرتے ہیں۔ Cas9 پروٹین کمپلیکس ذیلی یونٹس RuvC اور HNH میں اتپریرک سرگرمی ہے (ریکٹر ایٹ ال۔، 2012؛ اسماؤ اور زودی، 2021)۔ Cas9 subunit کا HNH نیوکلیز ڈومین crRNA سے وابستہ DNA اسٹرینڈ کو کلیو کرتا ہے۔ RuvC نیوکلیز ڈومین دیگر DNA اسٹرینڈز کو کلیو کرتا ہے اور ڈبل اسٹرینڈ بریکس (DSBs) پیدا کرتا ہے، جس کے بعد DNA بریک کی مرمت کے دو مختلف میکانزم چالو ہوتے ہیں (جیانگ اور ڈوڈنا، 2017) (شکل 1)۔
تصویر 1. CRISPR/Cas9 (A) کا جائزہ۔ CRISPR/Cas9 سسٹم کے اجزاء: (i)۔ Cas9 endonuclease ہدف ڈی این اے کی ترتیب کو کاٹنے کے لیے ذمہ دار ہے، (ii) ایک سنگل گائیڈ (sg) RNA جو crRNA اور tra-crRNA chimeras کے فیوژن کے نتیجے میں ہوتا ہے۔ (دو) Cas9 میں متعدد اجزاء شامل ہیں جیسے Rec I، Rec II، NUC lobe (HNH اور Ruv C ذیلی اجزاء ہیں) اور PAM تعامل ڈومین (C) متعلقہ افعال کے ساتھ۔ CRISPR/Cas9 پروٹین کمپلیکس DNA کی ترتیب کو غیر تکمیلی اور تکمیلی شکلوں (D) میں تقسیم کرتا ہے۔ CRISPR/Cas9 تین مراحل میں جینوم میں ترمیم کرتا ہے: شناخت، کاٹنا اور مرمت۔ ڈیزائن کردہ sg-RNA Cas9 کی رہنمائی کرتا ہے اور تکمیلی جزو crRNA کے ذریعے مطلوبہ ترتیب کو پہچانتا ہے۔ Cas9 PAM کی ترتیب کو 5′-NGG-3′ پر پہچانتا ہے اور DNA کو پگھلاتا ہے، DNA-RNA ہائبرڈ بناتا ہے اور کلیویج کو چالو کرتا ہے۔ Cas9 کا HNH ڈومین تکمیلی اسٹرینڈ کو کلیو کرتا ہے، اور RuvC ڈومین غیر تکمیلی اسٹرینڈ کو صاف کرتا ہے۔ CRISPR/Cas9 dsDNA کو دو طریقوں سے توڑ کر مرمت کرتا ہے: نان ہومولوجس اینڈ جوائننگ (NHEJ) اور ہومولوجی ڈائریکٹڈ ریپیر (HDR)۔ این ایچ ای جے غیر ملکی ہم جنس ڈی این اے کی غیر موجودگی میں دوہری پھنسے ہوئے ڈی این اے کی مرمت ایک انزیمیٹک عمل کے ذریعے کرتا ہے، ایک غلطی کا شکار میکانزم جو بے ترتیب ڈی این اے کی ترتیب کو داخل یا ہٹا سکتا ہے۔ HDR بہت مخصوص ہے اور اس کے لیے ہم جنس ڈی این اے ٹیمپلیٹس کی ضرورت ہوتی ہے۔
CRISPR/Cas9-ثالثی مرمت کے راستوں میں نان ہومولوجس اینڈ جوائننگ (NHEJ) اور ہومولوجی ڈائریکٹڈ ریپیر (HDR) میکانزم شامل ہیں۔ NHEJ ایک غلطی کا شکار راستہ ہے کیونکہ اس میں اندراج یا حذف کرنا شامل ہے اور مرمت کے طریقہ کار کے دوران کسی پیٹرن کی ضرورت نہیں ہے۔ یہ معیاری پروٹین بنانے کے لیے بے ترتیب نیوکلیوٹائڈز کا استعمال کرتا ہے (Abbasi et al.، 2021)۔ یہ مرمت کا نظام چار کمپلیکس پر مشتمل ہے جیسے کے یو کمپلیکس، کراس کمپلیمنٹنگ پروٹین کمپلیکس ٹائپ 4 (XRCC-4)، ڈی این اے اینڈ پروسیسنگ انزائم، اور پروٹین کناز DNA-PKcs (عباسی ایٹ ال۔، 2021)۔ KU کمپلیکس پروٹین کے دو ذیلی یونٹ ہوتے ہیں، Ku 70 اور Ku 80، اور NHEJ میکانزم میں ایک اہم کردار ادا کرتا ہے، کیونکہ مرمت کا طریقہ کار دو ذیلی یونٹس (Ku 70 اور Ku 80) کو ہدف DNA کے کند یا تقریباً کند سروں سے باندھ کر شروع کیا جاتا ہے (Abbasi et al. چوٹ کی جگہ سے NHEJ سے متعلق عوامل (یانگ ایٹ ال۔، 2020)۔ XRCC-4 اور DNA ligase بالترتیب 334 اور 911 امینو ایسڈز پر مشتمل ہیں، اور XRCC4-DNA ligase IV کمپلیکس DNA کے سروں کے ligation کو متحرک کرتا ہے ( Chatterjee et al.، 2015)۔ ڈی این اے اینڈ پروسیسنگ انزائم، جسے پولی نیوکلیوٹائڈ کناز 3′-فاسفیٹ بھی کہا جاتا ہے، ایک ڈی این اے اینڈ پروسیسنگ انزائم ہے۔ یہ DNA میں 3′P گروپ کو ہٹا سکتا ہے اور DSB مرمت کے دوران 5′OH گروپ کو فاسفوریلیٹ کر سکتا ہے۔ اس میں SSB مرمت کے راستے (Chatterjee et al.، 2015) کا استعمال کرتے ہوئے سنگل اسٹرینڈ بریکس (SSBs) کی مرمت بھی شامل ہے۔ پروٹین کناز DNA-PKcs ایک DNA پر منحصر پروٹین کناز ہے جو PIKKs (phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases) اور ataxia telangiectasia mutated (ATM) فیملی کے ساتھ ساتھ ATM اور Rad3 سے متعلق ATRs کے کیٹلیٹک سبونائٹ پر مشتمل ہے۔ اسٹرینڈ بریکس (DSBs) اور سنگل اسٹرینڈ بریکس (Yue et al.، 2020؛ Peng et al.، 2016)۔
ایچ ڈی آر ایک زیادہ درست اور مناسب مرمت کا طریقہ کار ہے کیونکہ معلومات کو ہومولوس ڈی این اے ڈوپلیکس کی برقرار شکل کا استعمال کرتے ہوئے کاپی کیا جاتا ہے، حالانکہ اس کے لیے بہن کرومیٹڈس کی موجودگی کی ضرورت ہوتی ہے۔ یہ ممالیہ سیل سائیکل کے S/G2 مرحلے کے دوران ہوتا ہے۔ ایچ ڈی آر بنیادی طور پر خمیری انواع میں پایا جاتا ہے، لیکن این ایچ ای جے ستنداریوں میں اہم ہے (برما وغیرہ، 2006؛ عباسی وغیرہ، 2021)۔ مکمل مرمت کا طریقہ کار تصویر 1 میں دکھایا گیا ہے۔
چونکہ TNBC جینیاتی اور ایپی جینیٹک اسامانیتاوں کی وجہ سے ہوتا ہے، اس لیے CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے مہلک جینومک/ایپی جینومک اسامانیتاوں کی اصلاح ایک معقول علاج کا طریقہ ہو سکتا ہے (چن ایٹ ال۔، 2019)۔ اس کے علاوہ، سیل مخصوص ٹرانسکرپشن ریگولیشن میں شامل کچھ ٹرانسکرپشن عوامل کینسر کے خلیوں کی منفرد خصوصیات کی نمائش کر سکتے ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ ٹرانسکرپشن ریگولیشن کینسر کے علاج کے لیے ایک بہترین طریقہ ہو سکتا ہے (Drost et al.، 2017)۔ ٹیومر کی ان مالیکیولر خصوصیات، جیسے کہ جینیاتی، ایپی جینیٹک اور ٹرانسکرپشنی نقائص، کو دوائیوں کی نشوونما کے لیے استعمال کرنا طبی نتائج کو بہتر بنا سکتا ہے اور اسکریننگ کے اخراجات کو کم کر سکتا ہے۔ سی آر آئی ایس پی آر ایک ممکنہ جین ایڈیٹنگ ٹول ہے جو نہ صرف کینسر پیدا کرنے والے جینومک اہداف کا پتہ لگا سکتا ہے اور اس کی شناخت کر سکتا ہے بلکہ اسے انسانی خلیات میں آنکوجینز میں ترمیم، دبانے اور ایپی جینیٹک طور پر ترمیم کرنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے (ٹیبل 1) (احمد ایٹ ال۔، 2021)۔ ٹیومر کو دبانے والے، آنکوجینز، اور منشیات کے خلاف مزاحمت سے وابستہ جینوں کو تلاش کرنے کے لیے کئی CRISPR اسکرینیں لگائی گئی ہیں۔ مختلف TNBC oncogenes میں ترمیم کرنے کے لیے CRISPR/Cas9 کا استعمال تصویر 2 میں دکھایا گیا ہے۔
شکل 2. CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے مختلف TNBC oncogenes کی جین ایڈیٹنگ جس کے نتیجے میں ٹیومر کی افزائش اور میٹاسٹیسیس میں کمی واقع ہوتی ہے۔ ان آنکوجینز میں CDK7، NAT1، UBR5، YTHDF2، ITGA9، CXCR4 اور CXCR7، Crypto1، ROR1 اور ST8SIA شامل ہیں، جو TNBC کی موجودگی اور میٹاسٹیسیس میں شامل ہیں۔
کینسر سیل کی منتقلی، حملہ، اور اپیٹیلیل-میسینچیمل ٹرانزیشن (EMT) ITGA9 سے وابستہ ہیں۔ پچھلے مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ITGA9 نوچ پاتھ وے میں ایک اہم کھلاڑی ہے اور رابڈومیوسارکوما میٹاسٹیسیس (مولسٹ ایٹ ال۔، 2020) میں ایک دلچسپ کردار ادا کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، ITGA9 کو کئی ٹیومر اقسام میں مریض کی تشخیص کے ساتھ قریبی تعلق پایا گیا، بشمول چھاتی کا کینسر (Wang Z. et al.، 2019)۔ اس کے علاوہ، ITGA9 کے بائیو انفارمیٹکس تجزیہ سے پتہ چلتا ہے کہ TNBC میں اس کا اظہار چھاتی کے کینسر کی دیگر ذیلی اقسام کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھا۔ بلند ITGA9 کی سطح TNBC مریضوں میں ٹیومر میٹاسٹیسیس اور دوبارہ لگنے سے وابستہ ہے۔ CRISPR/Cas9 کے ذریعے ITGA9 کے ناک آؤٹ کے نتیجے میں کینسر اسٹیم سیل (CSC) جیسی خصوصیات، ٹیومر انجیوجینیسیس، ٹیومر کی نشوونما، اور TNBC میں β-کیٹنین انحطاط کو فروغ دے کر میٹاسٹیسیس کو کم کیا گیا (Wang Z. et al.، 2019)۔
Crypto-1 TGF-β خاندان کا رکن ہے اور ابتدائی ایمبریوجنسیس، سٹیم سیل کی دیکھ بھال، اور کینسر میٹاسٹیسیس (Ishii et al.، 2021) کے لیے اہم ہے۔ Tdgf-1 کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، یہ ایک آنکوجینک جی پی آئی-اینکرڈ سگنلنگ پروٹین ہے جو پرائمیٹ اسٹریک، میسوڈرم اور اینڈوڈرم کی تشکیل کے ضابطے میں شامل ہے، نیز ایمبریوجنسیس کے دوران جسم کے اعضاء کی نشوونما میں بائیں/دائیں ہم آہنگی کے قیام (Zhang et al., 2021)۔ )۔ مزید برآں، کرپٹو-1 کو بطور سٹیم سیل مارکر (Zhang et al. EMT نہ صرف مختلف عملوں جیسے کہ جنین کی نشوونما، فائبروسس اور زخم بھرنے کے لیے، بلکہ کینسر کے حملے اور میٹاسٹیسیس کے لیے بھی اہم ہے۔ مزید برآں، کرپٹو-1 کو چار نوچ ریسیپٹرز کے ساتھ تعامل کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے اور ان کی ترجمے کے بعد کی پختگی (Brandstadter and Maillard, 2019) کو بڑھایا گیا ہے۔ نوچ سگنلنگ پاتھ وے انسانی چھاتی کے کینسر کے خلیوں کی دیکھ بھال میں ملوث ہونے کے لیے جانا جاتا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ Crypto-1 کا CRISPR/Cas9-ثالثی ناک آؤٹ کینسر کی نشوونما اور میٹاسٹیسیس کو دباتا ہے۔ لہذا، Crypto-1 TNBC کے لیے ایک اہم علاج کا ہدف بن سکتا ہے (Castro et al., 2015)۔
XCL12 پروٹین اور اس کے کیموکین ریسیپٹر CXC (CXCR4 اور CXCR7) کینسر کے خلیوں کے پھیلاؤ، نمو، منتقلی اور حملے میں مختلف کردار ادا کرتے ہیں (Wu et al.، 2015)۔ یہ chemoreceptors Vivo اور وٹرو ماڈلز (Wu et al.، 2015) دونوں میں ایک سے زیادہ سگنلنگ پاتھ ویز کے ذریعے TNBC کی ترقی سے وابستہ ہیں۔ اس کے علاوہ، CXCR4 اور CXCR7 کو چالو کرنا TNBC (Karn et al.، 2022) میں میٹاسٹیسیس کی زیادہ حساسیت اور خراب تشخیص سے وابستہ ہے۔ لہذا، CXCR4 اور CXCR7 کا ناک آؤٹ چھاتی کے کینسر کے علاج کے لیے مؤثر منشیات کے ہدف کے جین بن سکتے ہیں، بشمول TNBC۔ یانگ ایٹ ال کی طرف سے مطالعہ. یانگ ایٹ ال (2019) نے CXCR4 اور CXCR7 جینوں کو مشترکہ طور پر دستک دینے کے لئے CRISPR/Cas9 کا استعمال کیا اور پایا کہ TNBC پھیلاؤ، ترقی، منتقلی اور حملے کو نمایاں طور پر روکا گیا تھا (Yang et al., 2019)۔
miR-3662 کی بڑھتی ہوئی سطح، ایک TNBC oncogene، چھاتی کے کینسر کے ؤتکوں میں دیکھی گئی (Yi et al.، 2022)۔ miR-3662 کے ناک ڈاؤن کو چھاتی کے کینسر کے ٹیومر کی نشوونما اور میٹاسٹیسیس کو Vivo اور in Vitro دونوں میں روکتا دکھایا گیا ہے (اگروال اور گپتا، 2021)۔ HBP-1 Wnt/-catenin سگنلنگ کا ایک قوی روک تھام کرنے والا ہے اور TNBC خلیات کی miR-3662-ثالثی نمو کے لیے ممکنہ طور پر ذمہ دار ہے۔ حال ہی میں، Yi et al. پتہ چلا کہ miR-3662-HBP1 محور TNBC خلیات (Yi et al.، 2022) میں Wnt/-catenin سگنلنگ پاتھ وے کو منظم کرتا ہے۔ اس کے ٹیومر کے مخصوص اظہار کی وجہ سے، miR-3662 TNBC کے لیے ممکنہ علاج کا ہدف ہو سکتا ہے۔ اس طرح، miR-3662 کا CRISPR/Cas9-ثالثی دستک ڈاؤن TNBC کے علاج کے لیے نئی ادویات تیار کرنے کے لیے ایک بہترین طریقہ ہو سکتا ہے۔
UBR5 ایک 300 kDa nucleophosphoprotein ہے جس کی شناخت مختلف کینسروں میں ٹیومرجینیسیس، میٹاسٹیسیس، اور مدافعتی ردعمل کے کلیدی ریگولیٹر کے طور پر کی گئی ہے (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023)۔ UBR5 کو TNBC کے نمونوں میں انتہائی اپ گریڈ ہونے کی اطلاع دی گئی ہے اور اس کی ubiquitin ligase سرگرمی (Bolt et al. پرائمری TNBC نمونوں کے مکمل exome sequencing اسٹڈیز نے بھی UBR5 کے بڑھتے ہوئے اظہار کو دکھایا، جو TNBC کی ترقی میں اس کے کردار کی تجویز کرتا ہے۔ مزید برآں، CRISPR/Cas9 سے چلنے والے UBR5 کو حذف کرنے سے TNBC میٹاسٹیسیس کی نمایاں روک تھام اور تجرباتی ماؤس ماڈلز میں نمو ظاہر ہوئی۔ مزید برآں، جنگلی قسم کے ماؤس ماڈل میں UBR5 کی شمولیت نے اس کی مکمل فعالیت کو بحال کر دیا، جبکہ یہ اثر غیر فعال اتپریورتی تناؤ میں نہیں دیکھا گیا (Liao et al.، 2017)۔ UBR5 کی کمی خراب انجیوجینیسیس کی وجہ سے TNBC میں بڑھتی ہوئی apoptosis، necrosis، اور ٹیومر کی نشوونما کو روکنے سے منسلک ہے۔ UBR5 کے نقصان کی وجہ سے، دور دراز کے اعضاء میں ٹیومر کا پھیلاؤ کم ہو جاتا ہے، اور UBR5 بنیادی طور پر E-cadherin اظہار (Zhang and Weinberg, 2018) کو کم کر کے غیر معمولی EMT پیدا کرتا ہے۔ حال ہی میں، UBR5 کو TNBC میں IFN-γ-حوصلہ افزائی PDL1 ٹرانسکرپشن میں E3 ہر جگہ سرگرمی کی کمی کی وجہ سے ایک بہت اہم عنصر دکھایا گیا تھا۔ آر این اے ٹرانسکرپٹوم تجزیہ سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ UBR5 کے IFN-γ راستے سے وابستہ جینوں پر نظامی اثرات ہو سکتے ہیں اور پروٹین کناز RNA (PKR) اور اس کے سگنل ٹرانسڈیوسرز اور ایکٹیویٹر کی ایکٹیویشن لیول میں اضافہ کرکے PDL1 ٹرانس ایکٹیویشن کو فروغ دے سکتے ہیں۔ ٹرانسکرپشن 1 (STAT1) اور انٹرفیرون ریگولیٹری عنصر 1 (IRF1)۔ تاہم، UBR5 اور PD-L1 اظہار کے CRISPR/Cas9-ثالثی کے مشترکہ خاتمے کا اکیلے ناکہ بندی کے مقابلے میں ایک ہم آہنگی کے علاج کا اثر ہوتا ہے، جس کے ٹیومر مائکرو ماحولیات پر گہرے اثرات ہوتے ہیں (Wu et al.، 2022)۔ اس طرح، CRISPR/Cas9 UBR5 فنکشن کو روکنے کے لیے ایک اہم ٹول ہو سکتا ہے، اس طرح TNBC میٹاسٹیسیس اور ٹیومر کی نشوونما کو دباتا ہے۔
ROR1 ایک قسم کا I transmembrane پروٹین ہے جس کا اظہار کینسر اور برانن کی نشوونما کے دوران ہوتا ہے اور اس کی شناخت ایک oncofetal پروٹین (Nicholas Borcherding، 2014) کے طور پر کی گئی ہے۔ مختلف انسانی کینسروں کے ناگوار رویے کا تعلق ROR1 کے اپ گریجولیشن سے ہے۔ امید افزا نتائج Vivo اور in Vitro اسٹڈیز سے حاصل کیے گئے ہیں جن میں ROR1 (Chien et al.، 2016) کو نشانہ بنانے والے علاج کے مرکبات شامل ہیں۔ چھاتی کے ٹشو بایپسیوں میں ROR1 mRNA کی بلند سطح کا تعلق جارحانہ بیسل نما چھاتی (BL) ٹیومر اور جسم کے دوسرے حصوں میں ان کی منتقلی سے بھی کیا گیا ہے۔ مزید برآں، ROR1 کے اوور ایکسپریشن کی شناخت TNBC کی ترقی کے لیے ایک پروگنوسٹک مارکر کے طور پر کی گئی ہے (Chien et al.، 2016)۔ تاہم، TNBC کی ترقی اور میٹاسٹیسیس کو دبانے کے لیے CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے ROR1 کو خاموش کرنا ایک موثر حکمت عملی ہوگی۔
سیالیلیشن کے عمل میں گلائکوکونجگیٹس میں سیالک ایسڈ کا اضافہ شامل ہوتا ہے، جو سیال ٹرانسفریز (STs) کے ذریعے اتپریرک ہوتا ہے۔ ST8SIA1 کا تعلق ST خاندان سے ہے اور یہ مختلف بیماریوں جیسے lymphocytic leukemia اور Colorectal cancer (Chang et al., 2018) کے روگجنن میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ آر این اے کی ترتیب کے تجزیے سے پتہ چلتا ہے کہ ST8SIA1 TNBC مریضوں کے چھاتی کے بافتوں میں بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے اور یہ ٹیومر دبانے والے جین p53 میں تغیرات کے ساتھ مثبت طور پر منسلک ہوتا ہے، جو TNBC کے روگجنن میں حصہ ڈال سکتا ہے (Battula et al.، 2017)۔ اس کے علاوہ، ST8SIA1 TNBC کے میٹاسٹیسیس اور تکرار میں ملوث ہے، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ TNBC کی موجودگی اور ترقی میں اہم کردار ادا کرتا ہے۔ TNBC کے ایک ان وٹرو ماڈل میں، CRIPSR/Cas9 کے ذریعے ST8SIA1 کے دستک کو ترقی اور میٹاسٹیسیس کو روکتا دکھایا گیا تھا (بتولا ایٹ ال۔، 2017)۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ CRISPR/Cas9 TNBC کے علاج میں ST8SIA1 oncogene کے کام کو روکنے کے لیے ایک اہم ذریعہ ہو سکتا ہے۔
NAT1 ایک میٹابولک انزائم ہے جو فیز II xenobiotic مرکبات کی تشکیل کو متحرک کرتا ہے اور تقریبا تمام انسانی بافتوں میں ظاہر ہوتا ہے۔ NAT1 کوفیکٹر فولیٹ کو ایسٹیل-CoA (acetyl-CoA) کو نشانہ بنانے کے لیے استعمال کر سکتا ہے یہاں تک کہ خوشبودار امائن سبسٹریٹ کی عدم موجودگی میں بھی (Step et al.، 2015؛ Laurieri et al.، 2014)۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ NAT1 چھاتی کے کینسر کے خلیوں کے ماڈلز میں میٹرکس میٹالوپروٹینیز 9 (MMP9) کے فنکشن کو منظم کرتا ہے اور گلوکوز بھوک کے دوران ری ایکٹو آکسیجن اسپیسز (ROS) سے حفاظت کرتا ہے (Wang et al.، 2018)۔ NAT1 کو حذف کرنے سے pyruvate dehydrogenase کمپلیکس کو روکنا دکھایا گیا ہے، جس کے نتیجے میں mitochondrial dysfunction ہوتا ہے (Wang L. et al.، 2019)۔ مزید برآں، مختلف دیگر رپورٹس سے پتہ چلتا ہے کہ چھوٹے مالیکیولز کا استعمال کرتے ہوئے NAT1 کی روک تھام اور siRNA خاموشی چھاتی کے کینسر کے خلیات کی ناگواریت اور پھیلاؤ کو کم کر سکتی ہے (اسٹیپ ایٹ ال۔، 2018)۔ حال ہی میں، CRISPR/Cas9 کو چھاتی کے کینسر کی سیل لائن MDA-MB-231 میں NAT1 کو دبانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، جو اس کے اظہار کی سطح کے لحاظ سے سیلولر میٹابولزم کو متاثر کرتا ہے۔ اس مطالعہ نے یہ بھی ظاہر کیا کہ NAT-1 TNBC (Carlisle et al., 2020) کی ترقی اور میٹاسٹیسیس کے لئے اہم ہے۔
آنکوجینز کی مربوط نقل کو سپر بڑھانے والے، ٹرانسکرپشن عوامل اور کوفیکٹرز (Hnisz et al.، 2015) کے ذریعے منظم کیا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ، نقلی ضابطے کے لیے سائیکلن پر منحصر کنیز (CDKs) کا ایک گروپ، جیسے CDK7، CDK8، CDK9، CDK12، اور CDK13، کی ضرورت ہے۔ ان میں سے، CDK7 RNA پولیمریز II کے فاسفوریلیشن میں شامل ہے، جو TNBC کے روگجنن میں oncogene نقل کی ابتدا اور توسیع کے لیے بہت اہم ہے۔ ایک بنیادی مطالعہ میں، CRISPR/Cas9 کے ذریعے CDK7 کو حذف کرنے سے TNBC کو روکا گیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ TNBC کا روگجنن CDK7 پر منحصر ہے (Wang Y. et al.، 2015)۔
مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ MYC اور RBP (RNA بائنڈنگ پروٹین) میں تغیرات apoptosis کا باعث بن سکتے ہیں، جبکہ MYC یا RBP میں واحد جین کی تبدیلی کینسر کے خلیوں کی نشوونما کو متاثر نہیں کرتی ہے (آئنسٹائن ایٹ ال۔، 2021)۔ انسانی جینوم میں 1000 سے زیادہ RBPs کو CRISPR/Cas9 پر مبنی لائبریری کا استعمال کرتے ہوئے اسکرین کیا گیا ہے۔ ان میں سے، 57 RBPs انتہائی بلند MYC کی سطح کے ساتھ کینسر کے خلیوں کی نشوونما کے لیے اہم پائے گئے (Wheeler et al., 2020)۔ اس کے علاوہ، YTHDF2 TNBC سیل کی نمو کو برقرار رکھنے کے لیے اہم ہے اور اعلی MYC اظہار کے ساتھ کینسر کے خلیوں میں اعلیٰ سطح کی نقل اور ترجمے کے دوران میتھلیٹڈ ٹرانسکرپٹس کی مقدار کو کم کرتا ہے۔ مزید برآں، YTHDF2 کینسر کے خلیوں کے لیے ضروری نہیں ہے، جو TNBC کے مریضوں کی بقا کو طول دینے کے لیے MYC کی سطح پر کم انحصار کرتے ہیں (آئنسٹائن ایٹ ال۔، 2021)، یہ تجویز کرتا ہے کہ یہ TNBC پر قابو پانے والی ادویات کے لیے ممکنہ علاج کا ہدف ہو سکتا ہے۔
زنک فنگر پروٹین (ZNFs) کل انسانی جینوم کا تقریباً 1% بنتا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ ZNF مختلف کینسروں میں خلیوں کے پھیلاؤ کو منظم کرسکتا ہے، جیسے جگر کا کینسر، چھاتی کا کینسر اور کولوریکٹل کینسر (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017)۔ CRISPR ناک آؤٹ کے ذریعہ تیار کردہ لائبریریوں کو چھاتی کے کینسر کے خلیوں میں ٹیومر دبانے والے مختلف جینز (TSGs) کی اسکریننگ کے لیے استعمال کیا گیا ہے (Shalem et al.، 2014)۔ تب سے، CRISPR/Cas9 ZNF319-حذف شدہ چھاتی کے کینسر کے خلیات کے ٹرانسکرپٹومک مطالعہ سے پتہ چلتا ہے کہ ZNF319 ایک ٹیومر دبانے والا جین ہے جو چھاتی کے کینسر کے پھیلاؤ کو کم کرتا ہے اور اس وجہ سے مختلف ممکنہ سگنلنگ میکانزم اور دیگر حیاتیاتی افعال میں شامل ہے (Wang L. et al., 220)۔
فیروپٹوس ایک قسم کی پروگرام شدہ سیل کی موت ہے جو آئرن کی موجودگی پر منحصر ہے۔ یہ معلوم ہے کہ فیروپٹوسس کی ترقی لپڈ پیرو آکسائیڈ کی موجودگی سے متاثر ہوتی ہے۔ اس کے علاوہ، PKCβII کو ابتدائی لپڈ پیرو آکسائڈریشن کی نمائش کرنے کی اطلاع دی گئی ہے، اور بڑھتی ہوئی لپڈ پیرو آکسائڈریشن فیروپٹوسس سے منسلک ہے. CRISPR/Cas9-mediated kinase inhibitors کی لائبریری کی اسکریننگ سے یہ بات سامنے آئی کہ PKCβII لپڈ پیرو آکسیڈیشن کے عمل میں شامل ہے، جو MDA-MB-231 خلیوں میں فیروپٹوسس کے لیے اہم ہے (Zhang et al.، 2022)۔ لہذا، اس سے پتہ چلتا ہے کہ CRISPR/Cas9 کے ذریعے PKCβII کی ناک آؤٹ فیروپٹوسس سے متعلقہ بیماریوں کے علاج کے لیے ممکنہ ٹیومر دبانے والے جین کا ہدف ہو سکتا ہے (Zhang et al.، 2022)۔
خیال کیا جاتا ہے کہ منشیات کے خلاف مزاحمت کینسر کے مریضوں میں تقریباً 90 فیصد اموات کے لیے ذمہ دار ہے اور کینسر کے علاج میں ایک بڑا چیلنج ہے (Bukowski et al., 2020)۔ نتائج بتاتے ہیں کہ منشیات کے اخراج، ڈی این اے کی مرمت، اپوپٹوسس اور مختلف سیل سگنلنگ پاتھ ویز سے متعلق جینز کی کافی تعداد منشیات کے خلاف مزاحمت سے وابستہ ہے (حیدر ایٹ ال۔، 2020)۔ ان میں سے، CRISPR/Cas9 ٹولز کے ذریعے کئی جینز کو نشانہ بنایا گیا ہے اور انہوں نے منشیات کے خلاف مزاحمت کو کم کرنے اور کینسر کے خلاف علاج کی تاثیر کو بڑھانے میں امید افزا نتائج دکھائے ہیں (Vaghari-Tabari et al.، 2022)۔ اس کے علاوہ، ہائی تھرو پٹ CRISPR/Cas9 جین ناک آؤٹ اسکریننگ لائبریریوں کو ممکنہ منشیات کے مزاحمتی جین کے اہداف کے کام میں ترمیم کرنے میں ملوث کیا گیا ہے (Shalem et al.، 2015)۔ paclitaxel مزاحمتی جینوں کی شناخت کے لیے، RNA کی ترتیب کو جینوم وائیڈ sgRNA لائبریری اسکریننگ کے ساتھ آٹھ امیدوار جینوں کی شناخت کے لیے استعمال کیا گیا، جن میں ہسٹون ڈیسیٹیلیز 9 (HDAC9) شامل ہیں، جو کہ بار بار آنے والے TNBC (B et al.، 2020) کے مریضوں میں منشیات کی مزاحمت سے وابستہ ہیں۔ )۔ ایک اور تحقیق میں، ڈیسرین/تھریونائن اور ٹائروسین پروٹین کناز (DSTYK) کے بڑھتے ہوئے اظہار کو TNBC کے مریضوں کی بقا کے دوران دیکھا گیا جن کا علاج کینسر مخالف ادویات سے کیا گیا تھا۔ مزید برآں، DSTYK کے CRISPR/Cas9-ثالثی دستک نے وٹرو (SUM102PT خلیات اور MDA-MB-468 خلیات) اور ایک in Vivo TNBC ماڈل (Ogbu et al.، 2021) میں منشیات کے خلاف مزاحم کینسر کے خلیوں کے apoptosis کو نمایاں طور پر بڑھا دیا۔
اگرچہ TNBC میں MAPK پاتھ وے کی غیر معمولی ایکٹیویشن ہے، لیکن MEK-ہدف بنائے گئے علاج کا طبی اثر ناقص ہے۔ ایک CRISPR/Cas9 جینومک لائبریری اسکرین نے انکشاف کیا کہ PSMG2 (پروٹوم اسمبلی چیپیرون 2) کی روک تھام TNBC BT549 اور MB468 خلیوں کو MEK inhibitor AZD6244 کے لیے حساس بناتی ہے۔ PSMG2 کے CRISPR/Cas9 دستک ڈاؤن نے عام پروٹیزوم فنکشن کو تبدیل کر دیا، جس کے نتیجے میں PDPK1 کی آٹوفجی ثالثی سے جدا ہونا شروع ہو گیا، اس طرح AZD6244 (MEK inhibitor) اور MG132 (proteasome inhibitor) کے ذریعے TNBC ماؤس ماڈلز میں ٹیومر سیلز کو مزید بہتر بنایا گیا۔ اس طرح، ٹیومر سیل کے پھیلاؤ کو کم کرنے کے لیے پروٹیزوم اور MAP کناز (MEK) inhibitors کو ہم آہنگی سے دیا جا سکتا ہے (Wang X. et al.، 2022)۔
CRISPR/Cas9 کا استعمال TNBC مزاحمت (شو ایٹ ال۔ جی ایٹ ال نے TNBC میں BET بروموڈومین انحیبیٹر (BBDI) JQ1 کے ساتھ علاج کیے جانے والے کینسر کے خلیوں کی منشیات کے خلاف مزاحمت کے طریقہ کار کی وضاحت کی۔ CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے، انہوں نے پایا کہ rb1 جین کو حذف کرنے سے TNBC کینسر کے خلاف دوا JQ1 کے خلاف مزاحم بن گیا ہے۔ لہذا، TNBC میں JQ1 ادویات کے جواب میں rb1 فنکشن اہم ہے۔ انہوں نے یہ بھی بتایا کہ paclitaxel ایک CDK4/6 kinase/microtubule inhibitor ہے، اور BBDIs جیسے JQ1 کے ساتھ اس کا امتزاج منشیات کے خلاف مزاحمت کرنے والے TNBC (Ge et al., 2020) کے لیے امید افزا علاج کے ردعمل فراہم کر سکتا ہے۔
لانگ نان کوڈنگ آر این اے (lncRNA) کے ٹرانسکرپشنی لینڈ اسکیپ کو TNBC میں نیواڈجوانٹ تھراپی کے خلاف مزاحمت کا ذمہ دار بتایا گیا ہے۔ یہ مطالعہ ظاہر کرتا ہے کہ TNBC میں پانچ مختلف MALAT1 lncRNA ٹرانسکرپٹس کا بہت زیادہ اظہار کیا گیا ہے۔ مزید برآں، CRISPR/Cas9 کی طرف سے MALAT1 کو حذف کرنے سے TNBC BT-549 خلیوں کی paclitaxel اور doxorubicin کی حساسیت میں اضافہ ہوا، TNBC میں MALAT1 مزاحمت کے لیے ممکنہ کردار کی تجویز کرتا ہے (Shaath et al.، 2021)۔
BRCA1 (BRCA1m) میں تغیرات متفاوت ہیں اور اس لیے ان کا پتہ لگانا مشکل ہے۔ PARP1 (poly(ADP-ribose) پولیمریز کو نشانہ بنانا، BRCA1 کا مصنوعی مہلک پارٹنر، TNBC منشیات کی کیمو حساسیت کو بڑھا سکتا ہے۔ CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے، PARP1 کو حذف کرنے سے کینسر مخالف ادویات جیسے doxorubicin، gemcitabine اور docetaxel کی mBRCA1 اتپریورتی TNBC خلیات کی حساسیت میں اضافہ ہوا، یہ تجویز کرتا ہے کہ PARP1 TNBC میں منشیات کے خلاف مزاحمت میں بھی شامل ہے (Vaghari-Tabari et al. . ٹیومر کو دبانے والے جینز BRCA1 یا BRCA2 میں تغیرات لوگوں میں چھاتی کے کینسر کے امکانات کو بڑھانے کے لیے جانا جاتا ہے۔ ان مریضوں کے علاج کے لیے PARP inhibitors کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے۔ مزید برآں، یہ ظاہر کیا گیا ہے کہ CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے نیوکلیوٹائڈ سالویج فیکٹر DNPH1 کا ناک آؤٹ زہریلے نیوکلیوٹائڈ 5-hydroxymethyldeoxyuridine (hmdU) مونو فاسفیٹ کو ہٹا سکتا ہے، اس طرح بی آر سی اے کی کمی والے خلیوں کے ردعمل کو بڑھاتا ہے۔ وغیرہ، 2021)۔ اس طرح، CRISPR/Cas9 اور PARP1 روکنے والے TNBC کے لیے علاج کی ایک اہم حکمت عملی بن سکتے ہیں۔
پینیٹرینٹ گلائکوپروٹین (P-gp) جین ایک ملٹی ڈرگ مزاحمتی جین ہے جو عام طور پر تمام TNBC (Sun et al., 2020) کے تقریباً 41% میں اپ گریڈ ہوتا ہے۔ P-gp-حوصلہ افزائی منشیات کے بہاؤ کو چھاتی کے کینسر میں منشیات کے خلاف مزاحمت کے کلیدی ریگولیٹر کے طور پر شناخت کیا گیا ہے۔ P-gp inhibitors نے چھاتی کے کینسر میں کینسر مخالف ادویات کے لیے بڑھتی ہوئی حساسیت کا مظاہرہ کیا ہے (Famta et al.، 2021)۔ اس طرح، CRISPR/Cas9-ثالثی کا خاتمہ یا P-gp اور P-gp inhibitors کو دبانا TNBC میں منشیات کی مزاحمت پر قابو پانے کے بہت اہم طریقے ہو سکتے ہیں۔
ATP بائنڈنگ کیسٹ ٹرانسپورٹر G2 (ABCG2) TNBC (Palasuberniam et al., 2015) میں منشیات کے خلاف مزاحمت کا باعث جانا جاتا ہے، حالانکہ فی الحال CRISPR/Cas9 اور ABCG2 کے خاموشی اور ٹیومر کو دبانے والے جین کے غیر فعال ہونے کے درمیان تعلق کے بارے میں کوئی رپورٹ نہیں ہے۔ PTEN ABCG2 ایکٹیویشن کو بڑھا سکتا ہے (Palasuberniam et al.، 2015)، (Depak Singh et al.، 2021)۔ لہذا، ABCG2 کو ہٹانے کے لیے CRISP/Ca9 کا استعمال اور اسے ABCG2 inhibitor کے ساتھ ملانا TNBC میں منشیات کی مزاحمت پر قابو پانے کے لیے ایک مناسب علاج ہو سکتا ہے۔ جدول 2 میں CRISPR/Cas9 کا تذکرہ ہے جو تمام مزاحمتی جینوں کو نشانہ بناتا ہے۔
جدول 2. CRISPR/Cas9 مختلف TNBC مزاحمتی جینوں کو نشانہ بناتا ہے تاکہ خلیات کو کینسر مخالف ادویات کے لیے حساس بنایا جا سکے۔
CRISPR/Cas9 لائبریریاں کینسر کے روگجنن (Chan et al.، 2022) سے وابستہ جین کے تغیرات کی اسکریننگ کے لیے ممکنہ ٹولز ہیں۔ اس اسکریننگ کے طریقہ کار میں چار مراحل شامل ہیں جیسے (a) لائبریری کی تعمیر، (b) lentiviral transduction، (c) فینوٹائپک اسکریننگ، اور (d) ہدف جین کا تجزیہ۔ اگرچہ TNBC میں MAPK پاتھ وے کی غیر معمولی ایکٹیویشن ہے، لیکن ٹی این بی سی کے مریضوں کے لیے MEK ٹارگٹڈ تھراپی کی طبی تشخیص جو کہ PTEN، RB1، اور TP53 جیسے ٹیومر کو دبانے والے جینز میں تبدیلیاں لاتے ہیں بہت خراب ہے۔
مزید برآں، CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے ایک جین ناک آؤٹ اسکرین نے MDA-MB-231 پر dehydrocatrol کے اثر کو سمجھنے کے لیے انتہائی طاقتور اور منتخب مالیکیول، dehydrocatrol، جو گوئٹے مالا کے پھولوں اور پتوں کے عرقوں میں وافر مقدار میں پایا جاتا ہے، کا تجربہ کیا۔ سلیکٹیو سیل سائٹوٹوکسیٹی کے میکانزم۔ TNBC ذیلی قسموں کی Mesenchymal stemness کی خصوصیات۔ اس CRISPR/Cas9 پر مبنی اسکرین نے یہ بھی انکشاف کیا ہے کہ HSD17B11، ایک جین انکوڈنگ 17β-hydroxysteroid dehydrogenase type 11، MDA-MB-231 خلیوں میں بہت زیادہ ظاہر ہوتا ہے اور اس کے نتیجے میں MDA-MB-231 خلیوں کے لیے dehydrofalcarinol مخصوص ہوتا ہے (گرانٹ et. al. 2020)۔ اس طرح، اس سے پتہ چلتا ہے کہ CRISPR/Cas9 جینومک اسکریننگ میں ممکنہ قدرتی مرکبات کی اینٹی کینسر خصوصیات کے تحت میکانزم کی نشاندہی کرنے کی بڑی صلاحیت ہے۔
اس کے علاوہ، Vivo CRISPR/Cas9 اسکرین میں ایک غیر جانبدار جینوم کا استعمال کرتے ہوئے کینسر کے لیے TNBC کے خطرے کا مطالعہ کیا گیا، جس نے آنکوجینک اور ٹیومر کو دبانے والے راستوں کے درمیان تعلق ظاہر کیا۔ ایم ٹی او آر اور ہپپو پاتھ ویز کے کلیدی اجزاء کو ٹی این بی سی میں ٹیومر ریگولیشن میں اہم کردار ادا کرنے کی اطلاع ملی ہے۔ مزید برآں، مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ mTORC1/2 اور YAP oncoprotein کی فارماسولوجیکل روک تھام وٹرو ڈرگ-میٹرکس مطابقت پذیری ماڈل اور Vivo مریض سے حاصل شدہ زینوگرافٹس کا استعمال کرتے ہوئے TNBC کی روگجنکیت کو مؤثر طریقے سے روکتی ہے۔ مزید برآں، ٹورن-1-ثالثی mTORC1/2 روکنا میکروپینو سائیٹوسس کو بڑھاتا ہے، جبکہ ورٹی پورفن سے متاثرہ YAP روکنا TNBC سیل کی موت کا باعث بنتا ہے۔ ایک ساتھ مل کر، یہ نتائج Vivo CRISPR اسکریننگ میں جینوم کی طاقت اور مضبوطی کو نمایاں کرتے ہیں تاکہ TNBC (Dai et al., 2021) کے لیے نئے اور موثر علاج کی نشاندہی کی جا سکے۔
مدافعتی نظام کی بے ضابطگی ٹیومرجینیسیس میں ایک اہم عنصر ہے۔ کینسر کے خلیے دفاعی میکانزم کو نظرانداز کرکے مدافعتی کلیئرنس سے بچتے ہیں، بشمول ٹیومر مائیکرو ماحولیات میں مدافعتی خلیوں کی سرگرمی میں مداخلت اور مدافعتی نظام سے سمجھوتہ کرنا۔ لہذا، بہتر مدافعتی نظام تیار کرنا ٹیومر سے لڑنے کا ایک اہم نقطہ نظر ہوسکتا ہے۔ CRISPR/Cas9 پر مبنی جین میں ترمیم کا استعمال مختلف نقطہ نظر سے مدافعتی کمزوری سے متعلق کئی مسائل کو حل کرتا ہے۔ CRISPR/Cas9 کو مندرجہ ذیل راستوں کے ذریعے چھاتی کے کینسر کے خلاف اینٹیٹیمر قوت مدافعت کو بہتر بنانے کے لیے استعمال کیا گیا ہے (شکل 3)۔
شکل 3. CRISPR/Cas9 امیونو تھراپی TNBC خلیوں کو نشانہ بناتی ہے۔ CDK5 کا نقصان اور PDL1 اور CD155 کا ناک آؤٹ مدافعتی نظام کو بڑھاتا ہے۔ اسی طرح، A2AR کے نقصان اور TAAs جیسے HER2، mucin 1 اور TEM8 کے دستک نے کینسر کے خلیوں کو مارنے میں CAR-T خلیوں کی کارکردگی میں اضافہ کیا۔ CRISPR/Cas9 سے چلنے والی T سیل اسکریننگ نے ظاہر کیا ہے کہ p38 kinase میں خلل ٹی سیل اینٹیٹیمر سرگرمی کو بڑھاتا ہے۔ CRISPR/Cas9 کے ذریعے ترمیم شدہ T خلیات TCR (T سیل ریسیپٹر) کے اظہار کو بڑھاتے ہیں، جس کے نتیجے میں T خلیات میں اینٹیٹیمر سرگرمی ہوتی ہے۔
امیونو تھراپی کا مقصد کینسر کے خلیوں پر حملہ کرنے کے لیے مدافعتی نظام کو متحرک کرنا ہے۔ مدافعتی چیک پوائنٹ پروٹین کا زیادہ اظہار عام طور پر خود کار قوت مدافعت کو روکتا ہے لیکن کینسر کو ان سے بچنے میں مدد کر سکتا ہے (Topalian et al.، 2015)۔ یہ پروٹین مدافعتی خلیوں کی سطح پر رسیپٹرز سے منسلک ہو کر مدافعتی ردعمل کو روکتے ہیں۔ ایک سے زیادہ چیک پوائنٹ پروٹین (جیسے CD155 اور PD-L1) PD-1 ریسیپٹر کو مدافعتی خلیوں پر نشانہ بناتے ہیں اور چھاتی کے کینسر میں ظاہر ہوتے ہیں، خاص طور پر TNBC (Li Y.-C. et al., 2020)۔ CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے PD-L1 یا اس کے رسیپٹر کا ناک آؤٹ TNBC ٹیومر پر حملہ کرنے کے لیے مدافعتی نظام کو متحرک کر سکتا ہے (Yahata et al., 2019)۔ مزید برآں، CDK5 کے CRISPR/Cas9-ثالثی کو حذف کرنے کے ذریعے PD-L1 اظہار کی کمی کو وٹرو اور ویوو (Deng et al.، 2020) میں ٹیومر کی نشوونما کو روکنے کے لیے دکھایا گیا ہے۔ چھاتی کے کینسر کے ان وٹرو اور ان ویوو ماڈلز میں نمو کی روک تھام سے پتہ چلتا ہے کہ CD155 کی shRNA کی ثالثی میں کمی کا چھاتی کے کینسر پر علاج کا اثر ہو سکتا ہے (Gao et al.، 2018)۔
CAR T خلیات CARs کا اظہار کرتے ہیں جو ٹیومر سے وابستہ اینٹیجنز (TAAs) کو پہچانتے ہیں اور اپنی سرگرمی کو بڑھانے کے لیے چیک پوائنٹ پروٹین کے ناک ڈاؤن کا استعمال کر سکتے ہیں (Li C. et al., 2020)۔ چھاتی کے کینسر میں CAR T سیل تھراپی کے مختلف ممکنہ اہداف ہیں، جن میں کئی TAAs جیسے HER2، mucin1، اور TEM8 (Bajgain et al.، 2018) شامل ہیں۔ اس بات کے شواہد موجود ہیں کہ میسوتھیلین کو نشانہ بنانے والے CAR T خلیات (TNBC BT-459 خلیوں میں زیادہ متاثر) کینسر کے خلاف زیادہ موثر ہوتے ہیں جب PD-1 کو CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019) کا استعمال کرتے ہوئے ناک آؤٹ کیا جاتا ہے۔ تاہم، ٹی سیلز کو مریضوں سے الگ کرنا اور پھر ان میں ترمیم کرنا ایک محنت طلب اور وقت طلب عمل ہے۔ اگرچہ یونیورسل T خلیات تنہائی کی ضروریات کو کم کر سکتے ہیں، لیکن انسانی لیوکوائٹ اینٹیجن (HLA) کلاس I اور T سیل ریسیپٹر (TCR) کا اظہار کرنے والے ڈونر ٹی سیلز کو گرافٹ بمقابلہ میزبان اسامانیتاوں کو روکنے کے لیے ہٹا دیا جانا چاہیے (رین ایٹ ال۔، 2017)۔ ، 2017a)۔ CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے، HDR بیک وقت TCR اور HLA کو ختم کر سکتا ہے اور جین انکوڈنگ CAR کو ناک آؤٹ کر سکتا ہے۔ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ CRISPR/Cas9 کا استعمال اینٹی CD19 CARs کو TCR لوکس میں متعارف کروانے کے لیے کیا جا سکتا ہے، اس طرح T خلیات کو ختم کیے بغیر موثر طریقے سے CAR تیار کیے جا سکتے ہیں (Dimitri et al.، 2022)۔ TCR، beta-2-microglobulin (B2M)، HLA-I subunit اور دیگر پروٹین جیسے PD-1 اور CTLA-4 کو بیک وقت ختم کرکے اللوجینک CAR T خلیات پیدا کرنے کے لیے ملٹی پلیکس ٹیکنالوجیز تیار کی گئی ہیں، جن میں کینسر مخالف خصوصیات زیادہ ہوسکتی ہیں۔ TNBC کے خلاف (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022)۔
CRISPR/Cas9 کا استعمال CAR-T خلیوں کی تاثیر کو بہتر بنا سکتا ہے۔ اڈینوسین مدافعتی خصوصیات کے لیے جانا جاتا ہے اور ٹی سیل کے فنکشن کو روک کر اور اڈینوسین A2A ریسیپٹرز (A2AR) (Vigano et al. CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے A2AR کو خاموش کرنے سے Vivo میں CAR-T سیلز کی افادیت میں نمایاں بہتری آئی (Giuffrida et al., 2021)۔ ٹی خلیات مختلف فینوٹائپک خصوصیات جیسے سیلولر توسیع، تفریق، آکسیڈیٹیو تناؤ اور جینومک تناؤ کی نمائش کے لیے جانے جاتے ہیں۔ CRISPR/Cas9 پر مبنی T سیل اسکریننگ نے 25 مختلف T سیل ریسیپٹر کنیزوں میں خلل کا انکشاف کیا۔ ان میں سے، p38 کناز کو حذف کرنے سے T خلیات کی اینٹیٹیمر سرگرمی کو بڑھایا گیا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ p38 kinase CAR-T سیل ریگولیشن کا ایک کلیدی ریگولیٹر ہے ( Gurusamy et al., 2020)۔
ٹی سیلز کو جینیاتی طور پر CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے تبدیل کیا جا سکتا ہے تاکہ انتہائی اظہار شدہ TCRs تیار کیا جا سکے۔ جینیاتی طور پر تبدیل شدہ ٹی سیلز کو مریضوں میں منتقل کرنے میں اینڈوجینس ٹی سیلز کے مقابلے میں زیادہ مضبوط اینٹی کینسر سرگرمی دکھائی گئی ہے۔ لہذا، endogenous TCRs مریضوں میں جینیاتی طور پر تبدیل شدہ TCRs کے ساتھ مقابلہ کر سکتے ہیں، جو کینسر کے امیونو تھراپی کی صلاحیت کو متاثر کر سکتے ہیں۔ اس مسئلے پر قابو پانے کے لیے، وصول کنندہ کے خلیوں میں endogenous TCR-β کو ہٹانے کے لیے CRISPR/Cas9 کا استعمال اور بعد ازاں کینسر کے مریضوں کو TCR-β T خلیات کی منتقلی، endogenous TCR جنسی مقابلے کی ضرورت کے بغیر بہتر کینسر مخالف مدافعتی ردعمل ظاہر کر سکتی ہے (Fan et al. 2018)۔ اس طرح، CRISPR میں ترمیم شدہ T خلیات کی رعایت کے ساتھ، TCRs ٹیومر اینٹیجنز کے لیے عام TCR سے منتقل شدہ T خلیات سے ہزار گنا زیادہ حساس ہوتے ہیں۔ مزید برآں، مختلف لیوکیمیا میں، γδ TCR+ CRISPR کے ذریعہ تیار کردہ تبدیل شدہ T خلیات معیاری TCR کی منتقلی (Legut et al. اس طرح، CRISPR/Cas9 کے ذریعے تیار کردہ ترمیم شدہ T خلیات TNBC پر قابو پانے کے لیے ایک مؤثر امیونو تھراپی کا طریقہ ہو سکتا ہے۔
انٹیگرینز سیل چپکنے والے مالیکیولز ہیں جو سیلولر ٹرانس میبرینز میں موجود ہوتے ہیں اور خلیات کو ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (ECM) (حمیدی اور Ivaska، 2018) سے منسلک کرنے کو فروغ دیتے ہیں۔ انٹیگرینز کی بے ضابطگی ایکسٹرا سیلولر میٹرکس میں ردوبدل کرکے کینسر کی نشوونما اور ہجرت سے وابستہ ہے، جس کی وجہ سے گردش میں کینسر کے خلیوں کی بقا ہوتی ہے (حمیدی اور ایواسکا، 2018)۔ CRISPR/Cas9-mediated integrin knockdown TNBC میں ٹیومر کے بڑھنے، میٹاسٹیسیس، اور کالونائزیشن کو سست کر دیتا ہے۔ انٹیگرین اے 5 (آئی ٹی جی اے 5) کے ناک ڈاؤن کو دوسرے کینسر جیسے پھیپھڑوں کے کینسر میں سیل کی منتقلی اور بڑھنے کو کم کرنے کی اطلاع دی گئی ہے (جو ایٹ ال۔، 2017)، یہ تجویز کرتا ہے کہ انٹیگرین اے 5 بھی TNBC کے روگجنن میں ایک اہم عنصر ہوسکتا ہے۔
روایتی ایمبریونک اسٹیم (ES) سیل طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے ناک آؤٹ چوہوں کو پیدا کرنا ایک محنت طلب، وقت طلب اور غیر موثر عمل ہے۔ ہوموولوگس ری کمبینیشن کے ذریعے ES سیلوں کو نشانہ بنانے میں مہینوں اور سال لگتے ہیں، چائمرک چوہوں کی افزائش کرتے ہیں، اور پھر ہم جنس اولاد پیدا کرنے کے لیے انہیں ہیٹروزیگس چوہوں کے ساتھ عبور کرتے ہیں۔ متعدد جینیاتی تغیرات کے ساتھ چوہوں کو بنانے کے لیے پیچیدہ کراس بریڈنگ کی ضرورت ہوتی ہے۔ تاہم، CRISPR/Cas9 کا استعمال کرتے ہوئے ES خلیات کے خاتمے سے پیدا ہونے والے چوہوں کو استعمال کرتے ہوئے یا CRISPR/Cas9 اجزاء کو سنگل سیل فرٹیلائزڈ انڈوں میں مائیکرو انجیکٹ کرنے سے بہت سے مسائل پیدا ہوئے ہیں۔ مثال کے طور پر، تبدیلیوں کا تعارف اکثر بائیلیلک لوکی میں ہوتا ہے اور یہ جین سے مخصوص نہیں ہوتا ہے۔ حال ہی میں یہ اطلاع دی گئی تھی کہ CRISPR/Cas9 ٹیکنالوجی کا استعمال کرنے والے ES خلیے بیک وقت 5 جینز میں بائیلیلک تغیرات داخل کر سکتے ہیں (نشیزونو ایٹ ال۔، 2021)۔ اس مقصد کے لیے، Cas9 mRNA اور پانچ جین سے متعلق مخصوص gRNAs کو بیک وقت ES سیلز میں تبدیل کیا گیا۔ یہ اس طریقہ کار کے وعدے اور تاثیر کو نمایاں کرتا ہے، حالانکہ یہ تغیرات اس وقت گزر چکے ہوں گے جب فاؤنڈر لائنوں کو کوئنٹپل ناک آؤٹ چوہوں کی پیداوار کے لیے افزائش کی گئی تھی۔ مطالعہ ایک حیرت انگیز دریافت کی بھی اطلاع دیتا ہے: ES خلیات کو جینیاتی طور پر تبدیل شدہ چوہوں کو بنانے کی ضرورت نہیں ہے۔ اس کے بجائے، مخصوص جین کی مصنوعات کو ہٹانے کے لیے، Cas9 mRNA اور gRNA کو سنگل سیل اسٹیج ایمبریو میں انجکشن لگایا گیا تھا۔ نتیجے کے طور پر، ناک آؤٹ بانی لائنیں بنائی گئی ہیں جو نظریاتی طور پر چوہوں میں جین کے خاتمے کے نتائج کا مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کی جا سکتی ہیں (کن ایٹ ال۔، 2016)۔ اس طرح، CRISPR/Cas9 روایتی جینیاتی انجینئرنگ سے کم قیمت پر TNBC کے علاج کے لیے ٹرانسجینک چوہوں کی تخلیق کی اجازت دیتا ہے۔ CRISPR/Cas سسٹم کا استعمال کرتے ہوئے، ایک نیا ناک آؤٹ ماؤس ماڈل تیار کیا گیا ہے جو TNBC میں ایک یا زیادہ اینڈوجینس جینز میں پوائنٹ میوٹیشن کو کامیابی سے متعارف کرا سکتا ہے۔ اس تصور کی بنیاد پر، BRCA1 اور p53 کے CRISPR/Cas9-ثالثی حذف کا استعمال کرتے ہوئے TNBC کے جانوروں کے ماڈل بھی تیار کیے جا سکتے ہیں، جس کے نتیجے میں HR کی مرمت، جینومک عدم استحکام، اور اتپریورتی فینوٹائپس کا نقصان ہوتا ہے (Anunziato et al., 2020)۔
فی الحال، ٹی این بی سی کی تشخیص کے لیے مختلف طریقے جیسے میموگرافی، مقناطیسی گونج امیجنگ (MRI) اور الٹراساؤنڈ استعمال کیے جاتے ہیں۔ تاہم، ان طریقوں کی کچھ حدود ہیں۔ میموگرافی کا استعمال میٹاسٹیسیس کے بجائے مقامی چھاتی کے ٹشو کی تشخیص کے لیے کیا جاتا ہے، جہاں کینسر کے خلیے دوسرے اعضاء میں منتقل ہو چکے ہیں۔ الٹراسونوگرافی TNBC (چن اور لی-فیلکر، 2023) کی تشخیص کے لیے قابل اعتماد طریقہ نہیں ہے۔ ایم آر آئی میں الٹراساؤنڈ اور میموگرافی سے زیادہ حساسیت ہوتی ہے، لیکن اس کی تشخیصی درستگی محدود ہے (شا اور چن، 2022)۔ ٹشو بایپسی کینسر کے خلیات کی شناخت کا ایک ناگوار طریقہ ہے۔ تاہم، بعض صورتوں میں، اگر سوئی دلچسپی کے علاقے سے دور ہو جائے تو بایپسی کینسر کے ٹشو سے محروم ہو سکتی ہے۔ اس کے علاوہ، یہ بہت مہنگا ہے اور مریض کے لئے تکلیف دہ ہوسکتا ہے. TNBC کینسر کی ایک متفاوت قسم ہے، لہذا بایپسی کینسر کی قسم کے بارے میں کافی معلومات فراہم نہیں کرسکتی ہے۔ لہذا، TNBC کا پتہ لگانے کے لیے ایک نئے تشخیصی اعتبار سے قابل اعتماد طریقہ کی فوری ضرورت ہے۔ CRISPR/Cas9 چھاتی کے کینسر کی تشخیص کے لیے ایک انتہائی حساس اور کم سے کم حملہ آور متبادل کے طور پر کام کر سکتا ہے۔ اس مقصد کے لیے، CRISPR/Cas9 پر مبنی حکمت عملیوں کو TNBC کی تشخیص کے لیے PCR طریقوں کو بہتر بنانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ سب سے پہلے، CRISPR سسٹم کے Cas9 اور cpf1 پروٹین کو غیر مخصوص DNA کو ہٹانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اور پھر یہ دو پروٹین (Cas9 اور cpf1) ہدف کے DNA سے منسلک ہونے سے پہلے PAM کی ترتیب کو پہچان سکتے ہیں (دیپک سنگھ ایٹ ال۔، 2021)۔ . اس طرح، پی سی آر کینسر کی نشوونما سے وابستہ تغیرات کی نشاندہی کرسکتا ہے۔ متعدد مطالعات نے مختلف کینسروں میں مختلف تغیرات کا پتہ لگانے کے لیے اس CRISPR پر مبنی حکمت عملی کو اپنایا ہے ( Safari et al., 2019)۔ اس طرح، CRISPR پر مبنی PCR طریقے TNBC کی تشخیص کے ناگوار طریقوں جیسے کہ بایپسی پر مبنی امیونو ہسٹو کیمسٹری پر انحصار کو کم کر سکتے ہیں۔
ہارمون ریسیپٹر ریگولیشن میں جین ٹائپک تبدیلیاں بھی TNBC (چن اور روسو، 2009) میں ظاہر کی گئی ہیں۔ CRISPR/Cas9 پر مبنی PCR حکمت عملیوں کا استعمال کرتے ہوئے پوائنٹ آف کیئر تشخیص کے لیے مائیکرو رے ان تغیرات کی مؤثر طریقے سے نگرانی کر سکتے ہیں (حاجیان ایٹ ال۔، 2019)۔ یہ صحت کی دیکھ بھال فراہم کرنے والوں کو TNBC مریضوں میں مخصوص تغیرات کے بارے میں متعلقہ معلومات بھی فراہم کر سکتا ہے، جو ان کے علاج کے کورس کو بہتر بنانے میں مدد کر سکتا ہے۔ تاہم، اس مشترکہ تکنیک کی حدود ہیں۔ لہذا، TNBC کی تشخیص کے لیے اس CRISPR/Cas-PCR طریقہ کو صحت کی دیکھ بھال میں استعمال کرنے سے پہلے وسیع تحقیقی کوششوں کی ضرورت ہے۔